CircRNA鑒定及研究方法
環(huán)狀RNA（Circular RNA，縮寫(xiě)為CircRNA）屬于非編碼RNA（non-coding RNA, ncRNA），是近些年新興的一個(gè)重要研究熱點(diǎn)。CircRNA是一類(lèi)不具有5'端帽子和3'端poly(A)結構，并且以共價(jià)鍵形成環(huán)狀分子結構的RNA分子（圖1）。CircRNA主要是通過(guò)反向剪接（back-splicing）的方式產(chǎn)生，明顯不同于線(xiàn)性RNA（linear RNA）經(jīng)典的5'–3'的模式。
每一個(gè)研究熱點(diǎn)背后都有它的背景故事，從不被認知到受到廣泛的親賴(lài)。下面，就讓我們一起看一下CircRNA的發(fā)現史。
CircRNA發(fā)現史
◆ 1976年，美國農業(yè)部的科研工作者在馬鈴薯紡錘塊莖病的研究中發(fā)現類(lèi)病毒（Viroids）能侵染植株并導致死亡。但與常規病毒不同的是，發(fā)現的類(lèi)病毒并沒(méi)有蛋白質(zhì)外殼包被，核酸是單鏈、閉合、RNA分子。
◆ 1979年，洛克菲勒大學(xué)的Hsu和Coca-Prados，用電子顯微鏡在真核細胞細胞質(zhì)中觀(guān)測到環(huán)狀RNA的存在，這為CircRNA存在提供了最直接的證據。
◆ 1991年，Nigro在HCT116等人源細胞DCC基因中發(fā)現轉錄的CircRNA。
◆ 1993年，Capel在成年小鼠睪丸中發(fā)現精子決定基因Sry中存在CircRNA的轉錄。
◆ 2006年，Houseley在果蠅中發(fā)現來(lái)自于Muscleblind基因的未知環(huán)狀轉錄本。
◆ 2012年，Salzman通過(guò)RNA-Seq方法首次報道了大約80個(gè)環(huán)狀RNA分子。至此借助于高通量測序技術(shù)，環(huán)狀RNA的研究，正式開(kāi)始大量進(jìn)入人們的視野。
◆ 2013年，Nature雜志兩篇重要的研究論文揭示出一些環(huán)狀RNA充當分子“海綿”，結合并封閉了microRNAs。自此，環(huán)狀RNA在科學(xué)界受到了前所未有的關(guān)注。
隨著(zhù)環(huán)狀RNA功能、作用被逐步揭開(kāi)，環(huán)狀RNA的研究也越來(lái)越受到重視。接下來(lái)，就讓我們從CircRNA的分類(lèi)、作用、鑒定方法和研究方法四個(gè)方面，詳細的了解下circRNA。
CircRNA的分類(lèi)
CircRNA在各種動(dòng)物、植物、昆蟲(chóng)和真菌等均有發(fā)現。到目前為止，主要發(fā)現了大約183000種人源circRNA，96000種猴源circRNA和82000種鼠源circRNA[1]。與mRNA等線(xiàn)性RNA相比，circRNA在機體內的表達量較少，但表達模式卻與其線(xiàn)性同源RNA不同，其表達不依賴(lài)于其同源的線(xiàn)性RNA。
CircRNA按照含有的外顯子和內含子模式的不同，主要可以分為以下四類(lèi)：
1) 單外顯子circRNA，single exon circRNA；
2) 多外顯子circRNA，multi-exon circRNA；
3) 外顯子和內含子共存的circRNA，exon-intron circRNA；
4) 內含子circRNA，intronic circRNA；
CircRNA的作用
? 作為miRNA的sponge/decoy（海綿）
例如：在哺乳動(dòng)物的大腦中富含的CDR1as（也稱(chēng)作ciRS-7）包含有70多個(gè)miR-7的保守結合位點(diǎn)，在人源細胞系中減少CDR1as的表達，可以顯著(zhù)的減少包含有miR-7結合位點(diǎn)mRNA在細胞中的含量[6]。
? 作為RBP（RNA Bingding Protein）的sponge/scafford（海綿）
例如：與動(dòng)脈粥樣化疾病相關(guān)的CircANRIL，通過(guò)結合核糖體60S亞單元組裝因子，來(lái)抑制血管平滑肌細胞和巨噬細胞中核糖體的形成，從而造成動(dòng)脈粥樣化的壓力和細胞死亡[7]。
? 參與蛋白的翻譯或其本身被翻譯
例如：Circ-ZNF609可以不依賴(lài)于剪接和加帽而翻譯成蛋白，產(chǎn)生的蛋白在肌肉分化中起到一定的作用[8]。
? 調控基因的轉錄
例如：擬南芥中，SEPALLATA3（也稱(chēng)SEP3）是在花的同源異形表型中所必須的，而CircSEP3可以調控SEP3基因的剪切。CircSEP3來(lái)源于SEP3的外顯子6，并與之形成了一個(gè)RNA-DNA的雜合鏈，這導致了外顯子6的轉錄終止，從而發(fā)生了外顯子跳躍，導致產(chǎn)生了一個(gè)新的SEP3的mRNA剪切體[9]。
? 腫瘤發(fā)生的調控
例如：HPV（human papillomavirus）會(huì )產(chǎn)生包含有致癌性E7基因的CircE7，其中HPV-16產(chǎn)生的CircE7會(huì )翻譯生成E7致癌蛋白。在CaSki宮頸癌細胞中，減少CircE7含量會(huì )導致E7蛋白的減少，并且會(huì )抑制細胞的生長(cháng)，這項結果在細胞水平上和體內實(shí)驗都得到了驗證[10]。
? 神經(jīng)調控
例如：對正常個(gè)體和患有阿爾茨海默氏病個(gè)體的頂葉皮層組織進(jìn)行RNA-Seq分析顯示，CircRNA的表達量在早期的時(shí)候就有明顯的變化，而且這種變化獨立于其來(lái)源的線(xiàn)性RNA的表達[11]。
CircRNA還可能在免疫、發(fā)育等過(guò)程中起到重要的作用。
CircRNA的鑒定方法
RNase R消化檢測
RNase R是一種來(lái)源于大腸桿菌的核酸外切酶，它可以沿RNA的3’-5’方向切割、降解RNA，能夠消化幾乎所有的線(xiàn)性RNA分子，但不易消化呈環(huán)形的RNA、套索結構或3’端突出末端少于7 nt的雙鏈RNA分子（圖4）。
RNase R檢測并非是必須的，但可以作為一個(gè)很典型的實(shí)驗證明和鑒定circRNA。RNase R主要用于circRNA的鑒定和富集實(shí)驗，需要根據具體的實(shí)驗內容和目的決定是否進(jìn)行RNase R消化。
RNase R并不是絕對的不能消化circRNA，消化時(shí)間過(guò)長(cháng)、RNase R的用量過(guò)高都有可能會(huì )導致在酶消化后CircRNA的含量也有明顯降低（圖5），所以在使用RNase R進(jìn)行消化時(shí)，還要進(jìn)行相應的預實(shí)驗，設置好相應的對照，看是否對于所要研究的CircRNA有明顯的影響，保證實(shí)驗結果的準確性。
qPCR檢測
qPCR檢測通過(guò)引物特異性和位點(diǎn)設計來(lái)保證所檢測的為環(huán)狀RNA，一般多用于高通量測序后的數據驗證及后續功能研究的定量檢測（圖6）。Convergent引物作為參照，不管是基因組或線(xiàn)性RNA還是環(huán)狀RNA均可擴增，而Divergent引物只有環(huán)狀RNA可以被擴增出來(lái)。
如果是以qPCR進(jìn)行定量檢測，一般可以不做RNase R檢測，即不需要對circRNA進(jìn)行富集（線(xiàn)性RNA被消化）。
RNA-Seq檢測
CircRNA可以通過(guò)RNA-seq技術(shù)進(jìn)行大規模的鑒定，由于CircRNA在總RNA的含量占比比較低，為了增加CircRNA的檢出種類(lèi)和檢出效果，一般會(huì )對CircRNA進(jìn)行富集。富集的方法有很多種，大體上的原理都是通過(guò)技術(shù)手段去掉總RNA中不需要的RNA來(lái)達到富集的目的，比如使用RNase R消化總RNA、使用探針結合并去除核糖體RNA等。
進(jìn)行RNA測序后，就可以使用生物信息學(xué)工具或方法在全基因組范圍內鑒定circRNA。目前基于RNA-seq測序數據鑒定circRNA的方法主要是通過(guò)檢測是否有read能匹配到back-splicing junction (BSJ) site來(lái)判斷，即circRNA的首和尾連接處的序列。
CircRNA的研究方法
隨著(zhù)對CircRNA的了解，研究方法也在不斷的成熟。這里我們?yōu)榇蠹艺砹私陙?lái)的CircRNA的研究方法，供大家參考[1]
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參考文獻
[1] The expanding regulatory mechanisms and cellular functions of circular RNAs. Molecular Cell Biology.
[2] Electron microscopic evidence for the circular form of RNA in the cytoplasm of eukaryotic cells.Nature.
[3] Circular RNAs: Biogenesis, Function and Role in Human Diseases. Frontiers in Molecular Biosciences.
[4] Circular RNAs in the Mammalian Brain Are Highly Abundant, Conserved, and Dynamically Expressed. Molecular Cell.
[5] Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency.Nature.
[6] Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature.
[7] Expression of linear and novel circular forms of an INK4/ARF- associated non- coding RNA correlates with atherosclerosis risk. PLoS Genet.
[8] Circ-ZNF609 is a circular RNA that can be translated and functions in myogenesis. Mol. Cell
[9] A circRNA from SEPALLATA3 regulates splicing of its cognate mRNA through R-loop formation. Nat. Plants.
[10] Transforming activity of an oncoproteinencoding circular RNA from human papillomavirus. Nat. Commun.
[11] An atlas of cortical circular RNA expression in Alzheimer disease brains demonstrates clinical and pathological associations. Nat. Neurosci.
