qPCR檢測

實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一種研究基因表達量的重要方法，利用熒光信號的變化實(shí)時(shí)監測PCR擴增反應中每一個(gè)循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)Ct值和標準曲線(xiàn)的關(guān)系對起始模板進(jìn)行定量分析。

qPCR重要參數

? 擴增曲線(xiàn)

qPCR反應開(kāi)始時(shí)，熒光信號不穩定，呈現波動(dòng)狀態(tài)，隨后信號會(huì )趨于穩定并且呈現指數性增長(cháng)，到達一定循環(huán)數之后，熒光信號強度不再增加，持續穩定。  

擴增曲線(xiàn)展現出來(lái)為一條S型曲線(xiàn)，包括：基線(xiàn)期，指數擴增期，平臺期。反應完成后，qPCR儀會(huì )以基線(xiàn)期熒光信號標準偏差的10倍生成一條閾值線(xiàn)，閾值線(xiàn)與擴增曲線(xiàn)產(chǎn)生交點(diǎn)，交點(diǎn)對應的橫坐標代表Ct值，Ct值的含義代表每一個(gè)反應體系中熒光信號強度達到閾值時(shí)經(jīng)歷的擴增循環(huán)數，其本質(zhì)不難看出就是循環(huán)數，它是熒光定量中唯一用于后續計算的數值，是后續定量計算的基礎。

? 熔解曲線(xiàn)

熔解曲線(xiàn)是指隨著(zhù)溫度升高，反映DNA的雙螺旋結構降解程度的曲線(xiàn)。擴增反應完成后，通過(guò)逐漸增加溫度同時(shí)監測每一步的熒光信號來(lái)產(chǎn)生熔解曲線(xiàn)，熔解溫度上有一特征峰（Tm，DNA雙鏈解鏈50%的溫度），用這個(gè)特征峰就可以將特異性產(chǎn)物與其它產(chǎn)物如引物二聚體區分開(kāi)。

qPCR定量方法

定量方法包括相對定量和絕對定量，兩者的重要差異在于相對定量的結果是差異性的結果，涉及比較；而絕對定量的結果是一個(gè)具體數值，對于基因表達量而言是基因的拷貝數，不涉及任何比較。

? 相對定量

首先需要確定一個(gè)內參基因，常用的內參基因包括GAPDH、β-actin、18S rRNA，其本質(zhì)作用是利用內參基因的Ct值對目的基因的Ct值進(jìn)行均一化處理。其次，相對定量需要確定參照物，參照物選擇不同，所得的定量結果可能完全相反，經(jīng)常選擇的參照物一般是對照組或未處理組。

? 絕對定量

首先需要建立Ct值和拷貝數之間的線(xiàn)性關(guān)系，即標準曲線(xiàn)，由標準品生成。標準品中基因序列要與待測樣品中基因序列一致，從而保證引物在兩者中擴增效率完全相同。標曲是由不同梯度標準品生成，落在標曲上的梯度點(diǎn)最好有5個(gè)及以上，標準品和待測樣品同時(shí)反應，將待測樣品檢測的Ct值代入標曲后即可換算出待測樣品中基因的拷貝數。

qPCR檢測方法

qPCR最常用的兩種檢測方法分別為SYBR Green染料法和TaqMan探針?lè )ā?/span>

? SYBR Green染料法

在PCR反應體系中，加入過(guò)量SYBR Green熒光染料，其特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的熒光染料分子不會(huì )發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。

SYBR Green染料法需要注意引物的特異性，因為非特異擴增產(chǎn)物和引物二聚體均為dsDNA，所以該方法只能通過(guò)引物來(lái)保證特異性。

全式金推出的PerfectStart^? Green qPCR SuperMix采用PerfectStart^? Taq熱啟動(dòng)酶，采用3種抗體封閉，有效地封閉了DNA聚合酶活性，阻止了低溫下的非特異性擴增。

● 產(chǎn)品特點(diǎn)

? 3種抗體封閉，特異性高，靈敏度高，擴增效率強，適用物種范圍廣。

? 雙陽(yáng)離子緩沖液，增強特異性，減少引物二聚體形成，數據準確。

? 配有適用于不同機型的Universal Passive Reference Dye (調整PCR加樣誤差引起的管間差異)，數據準確。

● 3種抗體封閉原理圖

● 封閉效果

以不同濃度人gDNA為模板擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PerfectStart^? Taq熱啟動(dòng)酶的封閉效果。結果顯示，封閉后可顯著(zhù)提高擴增靈敏度和特異性。

以小麥cDNA為模板，qPCR檢測PerfectStart^? Taq熱啟動(dòng)酶的封閉效果。結果顯示，封閉后可顯著(zhù)提高擴增特異性。

● 擴增效率

以梯度稀釋的質(zhì)粒DNA (10 ng-0.1 pg，10倍稀釋 ) 為模板進(jìn)行qPCR擴增。結果顯示，TransGen產(chǎn)品擴增效率較高，可得到漂亮的擴增曲線(xiàn)和標準曲線(xiàn)。

● 無(wú)NTC擴增基因數量統計

使用TransGen與Company T的產(chǎn)品，擴增58個(gè)基因 (9個(gè)人的基因，7個(gè)小鼠的基因，17個(gè)水稻的基因，8個(gè)煙草的基因，4個(gè)擬南芥的基因，10個(gè)小麥的基因，3個(gè)玉米的基因)。無(wú)NTC擴增基因數統計。結果顯示，TransGen產(chǎn)品無(wú)NTC擴增基因數高于Company T，擴增效果更佳。

● 擴增靈敏度

以500 ng的人源RNA反轉錄(TransGen, AT311)后得到的cDNA為模板梯度稀釋?zhuān)謩e使用TransGen與Company T產(chǎn)品擴增β-actin (NTC無(wú)擴增 )。結果顯示，TransGen產(chǎn)品擴增靈敏度與Company T產(chǎn)品基本一致。

● 不同物種模板擴增

以不同物種的RNA反轉錄(TransGen, AT311)后得到的cDNA為模板分別使用TransGen與Company T的產(chǎn)品進(jìn)行擴增(NTC無(wú)擴增)。結果顯示，TransGen產(chǎn)品擴增效果與Company T產(chǎn)品基本一致。

● 產(chǎn)品穩定性

不同溫度保存及反復凍融處理后TransGen產(chǎn)品仍可穩定擴增。

? TaqMan探針?lè )?/span>

PCR反應開(kāi)始時(shí)，模板鏈經(jīng)熱變性解鏈形成單鏈，TaqMan探針和引物依次退火到模板上進(jìn)行鏈的延伸，延伸過(guò)程中Taq酶發(fā)揮5’-3’外切酶活性，遇到探針會(huì )從5’端逐個(gè)堿基切除探針，發(fā)光基團和淬滅基團分開(kāi)，因此熒光檢測系統可以接收到熒光信號，每擴增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，熒光信號的累積和PCR產(chǎn)物形成是同步的。

全式金推出的PerfectStart^? II Probe qPCR SuperMix UDG利用在PCR體系中加入熒光探針(TaqMan或Molecular Beacon等)，在擴增過(guò)程中其熒光量與擴增產(chǎn)物量成正比，最終通過(guò)熒光量的檢測測定樣本核酸量。

● 產(chǎn)品特點(diǎn)

? 3種抗體封閉，特異性高，靈敏度高，擴增效率高。

? 特殊優(yōu)化的qPCR反應緩沖液，可提供更高的靈敏度和特異性。

? 使用UDG酶和dUTP，有效防止PCR產(chǎn)物污染，數據準確。

? 配有適用于不同機型的Passive Reference Dye (調整PCR加樣誤差引起的管間差異)，數據準確。

? 適用范圍廣，已成功用于非洲豬瘟病毒、偽狂犬病病毒、哈維氏弧菌、蝦肝腸胞蟲(chóng)和副溶血性弧菌等檢測。

? 穩定性好，在反復凍融、預混液、常溫、37℃等條件下保存，均可穩定擴增。

? 提供可凍干版本。

● 多重PCR檢測

以牛病毒性腹瀉病毒(BVDV) cDNA、豬藍耳病病毒(PRRSV) cDNA、非洲豬瘟病毒(ASFV)質(zhì)粒、偽狂犬病病毒(PRV)gDNA混合物為模板，進(jìn)行qPCR檢測。結果表明，TransGen產(chǎn)品可進(jìn)行4重檢測。

● 高靈敏度、高擴增效率

分別以不同濃度豬藍耳病病毒(PRRSV) cDNA(10 pg、0.1 pg、0.01 pg)及不同濃度牛病毒性腹瀉病毒(BVDV) cDNA（100 pg、1 pg、0.1 pg）為模板，使用TransGen、Company V、Company T產(chǎn)品進(jìn)行qPCR檢測。結果表明，TransGen產(chǎn)品靈敏度可達0.1 pg，擴增效果優(yōu)于Company V與Company T。

● 適用范圍廣

TranGen產(chǎn)品可成功對不同濃度（107 copies/ml-104 copies/ml，10倍稀釋?zhuān)┑墓S氏弧菌、蝦肝腸胞蟲(chóng)和副溶血性弧菌DNA進(jìn)行檢測。

● 穩定性好

?批次穩定性

使用不同批次的TransGen產(chǎn)品進(jìn)行單重、四重qPCR檢測。結果表明，TransGen產(chǎn)品可保障穩定的批次重復性。

?凍融穩定性

使用5、10、15、20次反復凍融保存處理后的TransGen產(chǎn)品分別進(jìn)行單重、四重qPCR檢測。結果表明，反復凍融后TransGen產(chǎn)品性能不受影響，仍可穩定擴增。

?預混穩定性（單重）

將單重、雙重、三重檢測基因的引物探針與TransGen產(chǎn)品進(jìn)行預混，并在不同溫度處理7天后進(jìn)行qPCR檢測，結果表明，TransGen預混液在不同溫度保存后仍可穩定擴增。

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