等溫擴增技術(shù)系列

近些年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展持續推動(dòng)著(zhù)分子診斷技術(shù)的升級迭代，伴隨著(zhù)新冠疫情的爆發(fā)，分子診斷技術(shù)在疾病診斷中發(fā)揮著(zhù)重大作用，人們對分子診斷技術(shù)的重視程度達到了前所未有的高度。自沃森和克里克揭秘“生命之謎”-DNA雙螺旋結構始，分子診斷經(jīng)分子雜交技術(shù)、PCR技術(shù)、生物芯片技術(shù)和二代測序技術(shù)的不斷發(fā)展后，已經(jīng)在多個(gè)領(lǐng)域已得到廣泛應用，如傳染病的診斷、流行病學(xué)的調查、腫瘤和遺傳病的早期診斷、食品衛生安全等。

其中，作為分子診斷經(jīng)典技術(shù)之一的PCR，憑借其簡(jiǎn)便快速、高靈敏度、高特異性的優(yōu)勢，成為目前臨床基因擴增實(shí)驗室接受程度最高、應用范圍最廣的技術(shù)。然而，PCR技術(shù)是在體外通過(guò)反復的溫度變化來(lái)達到對目的片段在短時(shí)間內擴增數百萬(wàn)倍的效果，這也就意味著(zhù)PCR技術(shù)無(wú)法擺脫儀器設備的局限，不僅如此，PCR技術(shù)操作起來(lái)比較復雜，對人員要求也比較高，這些問(wèn)題進(jìn)一步限制了其在臨床現場(chǎng)檢測中的應用。為了解決PCR這一局限性，自20世紀90年代以來(lái)，很多實(shí)驗室開(kāi)始自發(fā)的研究無(wú)需熱變性的核酸等溫擴增技術(shù)(Isothermal Amplification Technology, IAT)。

等溫擴增技術(shù)是核酸體外擴增技術(shù)，其反應過(guò)程始終在一個(gè)恒定的溫度下進(jìn)行，通過(guò)在反應體系中添加不同活性的酶和各種特異性的引物來(lái)達到快速擴增的目的。經(jīng)過(guò)30多年的發(fā)展，主流的等溫擴增技術(shù)包括環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、交叉引物擴增(crossing priming amplification，CPA)、鏈替代擴增(strand displacement amplification，SDA)、重組酶聚合酶擴增(recombinase polymerase amplification，RPA)、依賴(lài)核酸序列的擴增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)、滾環(huán)擴增(rolling circle amplification，RCA)和依賴(lài)解旋酶的擴增(helicase-dependent amplification，HDA)。

在這些恒溫擴增技術(shù)中，以2000年日本學(xué)者Notomi在Nucleic Acids Res雜志上公開(kāi)的LAMP (Loop-mediated isothermal amplification)，也就是環(huán)介導等溫擴增反應最受關(guān)注，是目前最常見(jiàn)、應用最廣泛的等溫擴增技術(shù)，已占據超過(guò)60%的恒溫檢測市場(chǎng)。被廣泛地運用在病原微生物檢測和傳染性疾病診斷等領(lǐng)域，如SARS、AIV、HIV、COVID-19等疾病的檢測中，為已知基因的檢測提供簡(jiǎn)便、快速、特異、經(jīng)濟的檢測方法，顯示出令人鼓舞的應用前景。

LAMP原理

最初的LAMP反應是針對目的DNA鏈上的6個(gè)區域（F3、F2、F1、B1、B2、B3）設計4條引物，包含一對外引物（F3&B3）和一對內引物（FIP&BIP）。其原理是利用雙鏈DNA在65℃左右處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，在此溫度下，引物結合在雙鏈DNA的互補部位，鏈置換DNA聚合酶將DNA雙鏈解開(kāi)并進(jìn)行鏈置換，使DNA在15-60分鐘內即可擴增10⁹-10¹⁰倍。

LAMP擴增體系

基于LAMP擴增的原理，LAMP的擴增體系包括4條特異性引物、Bst DNA聚合酶緩沖液、Bst DNA聚合酶、dNTP、模板DNA、MgSO4。

4條特異性引物的組成：

· 正向外引物F3：由F3區域組成，該區域與F3c區域互補；

· 反向外引物B3：由B3區域組成，該區域與B3c區域互補。

· 正向內引物FIP：由與F2c區互補的F2區（3’端）和與5’端的F1c區相同序列組成。

· 反向內引物BIP：由與B2c區互補的B2區（3'端）和與5'端的B1c區域相同序列組成。

LAMP引物設計

正確的引物設計對于進(jìn)行LAMP擴增至關(guān)重要，LAMP引物設計時(shí)，需注意以下幾點(diǎn)：

·  引物間距：F2和B2的5'端之間的距離為120-180 bp，F2和F3以及B2和B3之間的距離為0-20 bp。莖環(huán)區域的距離（F2的5'到F1的3'，B2的5'到B1的3'）為40-60 bp。

·  引物的Tm值：高GC和正常情況下約60-65℃，高AT情況下約55-60℃。

·  引物末端的穩定性：從以下末端區域計算6bp的dG應小于-4 kcal/mol，分別是F1c/B1c 的5'末端和F2/B2以及F3/B3的3'末端。

·  GC含量：高GC和正常的情況下約為50-60%，高AT的情況下約為40-50%。

·  二級結構：引物設計應避免形成二級結構，3'序列應避免高AT或與其他引物互補。

·  其他：如果目標序列上存在限制性?xún)惹忻肝稽c(diǎn)，除了引物區域外，它們可以用來(lái)確認擴增產(chǎn)物。

LAMP反應核心的Bst DNA聚合酶，源于Geobacillus stearothermophilus（嗜熱脂肪芽孢桿菌），原菌種生長(cháng)于55-60℃的環(huán)境中。野生型Bst DNA Polymerase和其他DNA Polymerase I相似，包括三個(gè)活性區域: (I) 5’-3’外切酶活性結構域，(II) 5’-3’聚合酶活性結構域，(III) 3’-5’外切酶活性結構域，結構域II和III稱(chēng)為大片段(LF)（大片段的反應效率比全長(cháng)Bst高），位于Bst DNA聚合酶的羧基末端，缺失5’-3’外切酶活性。

Bst DNA聚合酶的鏈置換原理

LAMP擴增步驟

當目的基因和試劑在65℃條件下孵育時(shí)，等溫擴增反應分為2個(gè)階段進(jìn)行，分別是啞鈴狀模板結構的形成過(guò)程、循環(huán)擴增階段以及延伸循環(huán)階段。步驟如下：

1. 啞鈴狀模板結構的形成：內引物結合目的基因，在Bst DNA聚合酶的作用下延伸為雙鏈。外引物與雙鏈DNA的5’結合，在一端形成環(huán)狀結構。另一端經(jīng)過(guò)同樣過(guò)程，形成兩端為環(huán)的啞鈴狀結構。

2. 循環(huán)擴增階段以及延伸循環(huán)階段：以啞鈴結構DNA單鏈自身為模板不斷形成一端開(kāi)口的過(guò)渡性莖環(huán)結構DNA，由內外引物引導過(guò)渡性莖環(huán)結構DNA不斷發(fā)生鏈置換延伸反應，最后形成具有多個(gè)莖環(huán)結構的長(cháng)度不一的DNA混合物。

LAMP擴增步驟

LAMP擴增產(chǎn)物檢測

LAMP擴增后可產(chǎn)生大量具有不同長(cháng)度、不同數目莖環(huán)結構和反向重復序列的DNA混合物，此外，隨著(zhù)擴增反應的不斷進(jìn)行，副產(chǎn)物焦磷酸鎂的含量也在不斷增加。由于LAMP反應的特殊性，其擴增產(chǎn)物的檢測也存在多種方式。

· 瓊脂糖凝膠電泳法：通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對LAMP擴增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，檢測結果呈現瀑布狀梯形條帶，針對擴增產(chǎn)物中所包含的特異性酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切，還可以對擴增產(chǎn)物的特異性進(jìn)行驗證。但高濃度DNA產(chǎn)物容易產(chǎn)生氣溶膠造成實(shí)驗室環(huán)境污染。

· 濁度分析鑒定法：LAMP反應的效率極高，核酸在大量合成的同時(shí)，由dNTP析出的焦磷酸根離子與體系中的鎂離子結合，產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂，形成乳白色沉淀，焦磷酸鎂的產(chǎn)量與擴增產(chǎn)物濃度存在一定相關(guān)性?？捎萌庋塾^(guān)察擴增終末階段的乳白色沉淀判斷擴增有效性，也可利用濁度儀對濁度變化進(jìn)行實(shí)時(shí)監測。但濁度信號是來(lái)源于LAMP反應的副產(chǎn)物，而不是由引物特異性擴增的直接產(chǎn)物，因此無(wú)法完全排除檢測到非特異性擴增（如，由宿主來(lái)源的近源DNA片段或引物二聚體）的可能。

· 染色檢測法：根據染料對反應是否產(chǎn)生抑制，染料可在反應后或反應前添加。在反應后開(kāi)蓋添加，易在空氣中產(chǎn)生氣溶膠，并在之后的檢測中造成假陽(yáng)性。染料和輔助劑的種類(lèi)也會(huì )對反應效率及結果判斷造成影響。因此，根據染料、輔助劑的作用特點(diǎn)進(jìn)行合理的選擇及應用，對LAMP結果的正確性和可靠性有重要意義。染料的種類(lèi)有很多，應用較多的有3種：鈣黃綠素、SYBR Green 和羥基萘酚藍。

· 免疫試紙條法：特異性擴增產(chǎn)物能夠同時(shí)被質(zhì)控線(xiàn)（C）和檢測線(xiàn)（T）上的抗體捕獲并顯現為兩條紅色條帶，而非特異性擴增的樣品則僅僅顯示為質(zhì)控線(xiàn)（C）紅色，但該方法需要借助其他的裝置來(lái)防止核酸擴增結束后開(kāi)蓋可能造成的交叉污染。

· 實(shí)時(shí)熒光法：利用SYBR Green I等熒光染料能夠與雙鏈DNA特異性結合的特性，通過(guò)核酸擴增過(guò)程中的熒光強度變化來(lái)實(shí)時(shí)、定量地檢測雙鏈DNA的產(chǎn)量。該方法具有重復性高、能夠定量、實(shí)時(shí)分析的特點(diǎn)，但需要復雜的儀器，成本高。

· 熒光探針?lè )ǎ合騆AMP反應體系中加入標記不同熒光素的特異性探針，可用于多重基因的檢測，具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)勢。但需要復雜的儀器，成本高。

· 微流控芯片法：該方法具有特異性強、敏感度高、耗樣量少、耗時(shí)短、檢測效率高、操作簡(jiǎn)便等諸多優(yōu)點(diǎn)。將環(huán)介導等溫核酸擴增和微流控芯片技術(shù)相結合，建立單重/多重、定性/定量的LAMP微流控芯片模塊，有利于發(fā)展快速、靈敏、特異和適合床邊檢測的生物分子分析技術(shù)。但需要復雜的儀器，成本高。

LAMP的優(yōu)勢與限制

LAMP的優(yōu)勢：

· 不需額外的步驟將雙鏈DNA變成單鏈DNA；

· 擴增反應在等溫條件下連續進(jìn)行；

· 擴增效率極高，在15-60分鐘內使DNA的量放大109-1010倍；

· 通過(guò)4個(gè)引物來(lái)識別6個(gè)區域，擴增的特異性強；

· 不需要特殊的試劑或復雜的設備，成本低；

· RNA模板的擴增過(guò)程與DNA模板相同，只需添加逆轉錄酶。

LAMP的限制：

· 引物設計要求高；

· 產(chǎn)物不能用于克隆或測序；

· 容易形成氣溶膠污染，造成假陽(yáng)性。

產(chǎn)品推薦

全式金作為國產(chǎn)生物試劑優(yōu)質(zhì)供應商，為滿(mǎn)足廣大客戶(hù)對LAMP技術(shù)在病原微生物檢測、傳染性疾病診斷和食品衛生安全等領(lǐng)域的應用需求，推出Bst II DNA Polymerase和Bst III DNA Polymerase，助力診斷試劑開(kāi)發(fā)。

Bst II DNA Polymerase (LP301)

適用于以DNA為模板的LAMP反應，擴增能力強、特異性高，在熒光定量法（染料法、探針?lè )ǎ㎜AMP反應中具有極佳的反應性能。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

· 操作簡(jiǎn)單：包含反應所需組分，只需自備模板及引物探針即可；

· 高效率：強鏈置換及聚合酶活性，實(shí)現恒溫條件下快速、高效、特異性的LAMP擴增；

· 兼容dUTP/UDG：對dUTP耐受性好，添加dUTP/UDG有效防止LAMP產(chǎn)物的交叉污染，數據準確。

實(shí)驗數據：

兼容dUTP/UDG防污染系統

以ASFV-p72質(zhì)粒和Pre-LAMP Product為模板，使用TransGen產(chǎn)品進(jìn)行LAMP擴增。結果表明，TransGen產(chǎn)品對dUTP耐受性好，高度兼容dUTP/UDG系統，有效避免交叉污染。

擴增靈敏度高

以不同濃度的番鴨細小病毒（MDPV）質(zhì)粒為模板，使用TransGen產(chǎn)品進(jìn)行LAMP擴增。結果表明，TransGen產(chǎn)品擴增靈敏性高，特異性好，檢出限可到fg級別。

注：1*10² copies濃度為fg級別

擴增速率快

在同等模板濃度條件下，分別使用TransGen產(chǎn)品和Company N產(chǎn)品進(jìn)行LAMP擴增。結果表明，TransGen產(chǎn)品擴增速率更快。

反應可視化

以ASFV-p72基因質(zhì)粒為模板，使用TransGen產(chǎn)品進(jìn)行濁度法、HNB和中性紅顯色法LAMP擴增，63℃反應30 min。結果表明TransGen產(chǎn)品可進(jìn)行可視化操作，擴增結果均可通過(guò)顏色變化進(jìn)行判讀。

1-4：ASFV-p72基因質(zhì)粒；5-8：NTC

Bst III DNA Polymerase (LP311)

適用于以RNA為模板的RT-LAMP反應，具有極強的反轉錄活性和擴增能力，可在30分鐘內檢測低至1拷貝的RNA分子，適用于熒光染料法、熒光探針?lè )ā?/span>

產(chǎn)品特點(diǎn)：

· 操作簡(jiǎn)單：包含反應所需組分，只需自備模板及引物探針即可；

· 高效率：一步法進(jìn)行反轉錄（RT）及LAMP擴增，恒溫條件下快速、高效、特異性的擴增模板；

· 兼容dUTP/UDG：對dUTP 耐受性好，添加dUTP/UDG有效防止LAMP產(chǎn)物的交叉污染，數據準確；

· 提供可凍干反應體系：高濃度Bst III酶活穩定，可用于凍干反應體系的建立。

實(shí)驗數據：

擴增效率高

以鴨、鵝呼腸孤病毒（DuRV）體外轉錄RNA為模板，分別使用TransGen產(chǎn)品和Company N產(chǎn)品進(jìn)行LAMP擴增。結果表明，TransGen產(chǎn)品擴增效率更高。

擴增靈敏度高

以不同濃度的鴨、鵝呼腸孤病毒（DuRV）體外轉錄RNA為模板，使用TransGen產(chǎn)品進(jìn)行RT-LAMP擴增。結果表明，TransGen產(chǎn)品擴增靈敏性高，特異性好，檢出限可到fg級別。

注：1 copy濃度為fg級別

可進(jìn)行凍干

以鴨、鵝呼腸孤病毒（DuRV）體外轉錄RNA為模板，使用常規和凍干體系 TransGen產(chǎn)品進(jìn)行RT-LAMP擴增。結果表明，TransGen產(chǎn)品擴增效果穩定，可用于凍干體系研究。

參考文獻：

【1】 Soroka M, Wasowicz B, Rymaszewska A. Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP): The Better Sibling of PCR?. Cells. 2021;10(8):1931. Published 2021 Jul 29.

【2】 Li JJ, Xiong C, Liu Y, Liang JS, Zhou XW. Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP): Emergence As an Alternative Technology for Herbal Medicine Identification. Front Plant Sci. 2016;7:1956. Published 2016 Dec 26.

【3】 姜蘇,李一榮.等溫擴增技術(shù)的原理及應用[J].中華檢驗醫學(xué)雜志,2020,43(05):591-596.