外泌體系列

外泌體（Exosome）由細胞產(chǎn)生，是直徑介于30-150 nm的磷脂膜分泌性囊泡，廣泛存在并分布在各種體液中（如血清、血漿、唾液、尿液）和細胞培養液等。目前的主流觀(guān)點(diǎn)認為，外泌體的產(chǎn)生先是由細胞膜內陷，形成早期內小體（Early endosome），成熟晚期內小體（Late endosome）的膜向內萌發(fā)形成腔內小泡（intraluminal vesicles，ILV）并轉化為多泡體（multivesicular bodies，MVB）。在MVB與質(zhì)膜融合后，ILV被釋放到細胞外形成外泌體（Exosome）。外泌體中攜帶有母細胞的多種蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、DNA和RNA等生物活性分子，參與機體多種生理和病理過(guò)程。

外泌體形成過(guò)程^[1]

外泌體的發(fā)展歷程

目前，已有越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始關(guān)注外泌體在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用及其機制，外泌體將在癌癥的診斷及治療等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。有關(guān)外泌體的研究，主要集中在外泌體顆粒的提取、純化和內容物分析上。

外泌體的作用

1. 作為藥物的載體進(jìn)行藥物靶向治療

 RNA藥物治療是一項極具潛力的治療手段，但是由于難以掌握RNA藥物遞送的穩定性和特異性，它的應用難度也隨之增加。利用外泌體進(jìn)行RNA的傳遞則可以解決這個(gè)問(wèn)題。例如：將加載融合RVG肽的Lamp2b蛋白的外泌體靜脈注射至小鼠體內，檢測發(fā)現其特異性的敲降了小鼠體內BACE1（阿爾茨海默病的治療靶點(diǎn)）的表達^[2]。

2. 作為細胞間的信號分子，用于細胞交流

 外泌體作為細胞間的信號分子，在細胞間的信息傳遞中發(fā)揮著(zhù)重要作用。例如：MPC（肌源性祖細胞）分泌含有miR-206的外泌體，來(lái)抑制成纖維細胞中Rrbp1（膠原蛋白合成的主要調節劑）的產(chǎn)生，從而防止過(guò)多的膠原蛋白在ECM（細胞外基質(zhì)）沉積，以穩定組織狀態(tài)^[3]。外泌體miR-155中miRNA可以調節下游細胞對胰島素的敏感性^[4]。

3. 調節細胞內分子水平，從而調節細胞活性

 外泌體不僅可以作為細胞間信號調節的載體，也可以主動(dòng)運載細胞內各種成分，進(jìn)而調節細胞活性。例如：當MLKL被RIPK3磷酸化以后，磷酸化的MLKL會(huì )引起細胞的死亡，然而MLKL產(chǎn)生的外泌體可將磷酸化MLKL裝入囊泡，并分泌到細胞外，使細胞免受死亡^[5]。

4. 作為分子診斷的Marker，用于疾病的診斷

 相比于傳統活檢，液態(tài)活檢取樣方便、對機體損傷小。存在于體液和細胞培養液的外泌體因其特異性和相對穩定性，在作為疾病診斷的Biomaker方面具有很大的潛力。例如：前列腺癌基因3（Prostate Cancer Associated 3，PCA3）、跨膜絲氨酸蛋白酶2 (Transmembrane Serine Proteases 2，TTSPs 2)和ETS 相關(guān)基因（ETS-related gene，ERG）融合基因在PCa患者尿液外泌體中表達，尿液外泌體具有作為PCa診斷的的潛力^[6]。Raimomlo等對比了腎癌患者尿液中檢測到的186個(gè)蛋白，發(fā)現其中10個(gè)蛋白的表達有明顯差異，腎癌患者顯著(zhù)高表達MMP9、DKK4和CAIX，且與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)，提示它們有望成為潛在的分子標志物，為腎癌診斷和治療提供有價(jià)值的臨床信息^[7]。

外泌體的提取方法

目前外泌體常見(jiàn)的提取方法包括超速離心法、密度梯度離心、聚合物沉降法和特異性抗體捕獲等方法。

1. 超速離心法

優(yōu)點(diǎn)：方法簡(jiǎn)單，適合大劑量的樣品處理。

缺點(diǎn)：操作繁瑣，費時(shí)費力，離心力可能導致外泌體結構破壞，對設備要求高。

2. 密度梯度離心法

優(yōu)點(diǎn)：純度相對較高，適合大劑量的樣品處理。

缺點(diǎn)：操作繁瑣，費時(shí)費力，對設備要求高。

3. 聚合物沉降法

優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，不需要超速離心機，得到的外泌體數量較多，適合大劑量的樣品處理。

缺點(diǎn)：雜質(zhì)含量會(huì )比較多，尤其是一些雜蛋白。    

4. 分子排阻法

優(yōu)點(diǎn)：純度相對較高，且外泌體結構不易受到破壞。

缺點(diǎn)：大小相近的顆粒也會(huì )被純化出來(lái)，比如乳糜微粒、低密度脂蛋白等。

5. 超濾法

優(yōu)點(diǎn)：操作方便，富集效率比較高，成本較低。

缺點(diǎn)：外泌體易損耗變形，導致膜堵塞，純度較低，大顆粒蛋白污染嚴重，附著(zhù)于膜上的外泌體難以回收，導致提取損失。

6. 磁珠特異性捕獲法

優(yōu)點(diǎn)：外泌體純度較高，并且對外泌體膜結構影響較小。

缺點(diǎn)：成本較高，無(wú)法進(jìn)行大劑量的提取，磁珠保存難度比較高。

目前外泌體提取方法，普遍存在回收率低，純度低，操作繁瑣，結構不完整等問(wèn)題。針對上述問(wèn)題，北京全式金生物技術(shù)有限公司開(kāi)發(fā)了兩款外泌體提取新產(chǎn)品，可從血清、血漿、細胞上清和尿液中提取外泌體，適用于下游的電鏡分析、NTA分析、納米流式（NanoFCM）分析、Western Blot、熒光定量（qPCR）等應用。

TransExo^? Cell Media Exosome Kit

 針對細胞上清中外泌體提取、純化的產(chǎn)品，所得的外泌體具有高純度、高活性的優(yōu)點(diǎn)，可以用于Western Blot、透射電鏡、qPCR、粒徑等多種檢測方式。

●  操作簡(jiǎn)單，無(wú)須超速離心。

●  樣本需求量少，靈敏度高。

電鏡檢測

使用TransGen和Company Q產(chǎn)品提取MDA-MB-231和Hela細胞上清中外泌體，

電鏡檢測結果顯示均可檢測到結構完整的外泌體。

外泌體標志性蛋白檢測

MDA-MB-231 細胞分別進(jìn)行饑餓誘導處理和無(wú)血清培養基培養，使用 TransGen 產(chǎn)品和 Company Q 產(chǎn)品提取細胞上清中的外泌體，WB 檢測結果顯示均可檢測到外泌體的標志蛋白 TSG101、CD63、CD81。

外泌體RNA檢測

使用 TransGen 和 Company Q 產(chǎn)品成功提取外泌體后進(jìn)行 total RNA 提取，反轉錄后定量檢測miRNA (miR-92a)、lncRNA (RN7SL)、mRNA (MTND4) 表達。結果顯示均可檢測到三種 RNA 表達。

適用于多種細胞上清外泌體提取

TransGen 產(chǎn)品提取不同種類(lèi)細胞上清中的外泌體，WB 檢測結果顯示均可檢測到

外泌體的標志蛋白 TSG101。

TransExo^? PS Exosome Isolation Kit (FE601)

 以磁珠為核心原料，通過(guò)磷酯酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）親和受體蛋白的作用，特異性捕獲血清、肝素血漿、尿液、細胞培養上清等多種樣本中的外泌體。提取的外泌體適用于Western Blot、qPCR、電鏡、納米粒子追蹤等多種檢測，同時(shí)可用于細胞共培養。

? 操作簡(jiǎn)單，無(wú)需超速離心，能夠在3 小時(shí)內完成外泌體純化。

? 相較于超速離心法，特異性更強，純度更高。

? 洗脫條件溫和，提取的外泌體形態(tài)良好，結構完整，活性高。

原理示意圖

粒徑檢測

使用TransGen 產(chǎn)品提取HEK-293T 細胞上清、血清和尿液中的外泌體，經(jīng)粒徑檢測，提取的外泌體平均粒徑在100 nm左右。

電鏡檢測

使用TransGen 產(chǎn)品提取HEK-293T 細胞上清、血漿和尿液中的外泌體，

經(jīng)電鏡檢測，提取的外泌體呈經(jīng)典的盤(pán)狀囊泡形態(tài)，結構完整。

外泌體標志性蛋白檢測

使用TransGen 產(chǎn)品提取血清、血漿、尿液和多種類(lèi)型細胞上清中的外泌體，WB 檢測外泌體標志物CD63 和TSG101 的表達。

外泌體 RNA 檢測

使用TransGen 產(chǎn)品提取不同種類(lèi)樣本的外泌體后進(jìn)行total RNA 提取，可檢測到多種miRNA(has-miR-150-3p、has-miR-16-1-3p、

has-let-7a-5p、has-miR-92a-3p) 、lncRNA(RN7SL)、mRNA(Actin) 的表達。

活性檢測

在MDA-MB-231 細胞中加入TransGen 產(chǎn)品提取的外泌體后，細胞遷移率隨著(zhù)加入外泌體的含量增加而提高，表明提取的外泌體具有生物活性。

與沉淀法提取外泌體的比較

分別用磁珠法和沉淀法提取HEK-293T 細胞上清的外泌體，WB 檢測相同總蛋白中的

外泌體標志物CD63 和CD81 的表達，結果表明，磁珠法提取的外泌體純度更高。

 外泌體是由細胞分泌的膜性小囊泡，攜帶著(zhù)細胞來(lái)源的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA和RNA等分子。這些物質(zhì)作為細胞間的信號分子，用于細胞間交流。開(kāi)展外泌體中RNA研究，有助于深入了解外泌體的作用。全式金生物開(kāi)發(fā)了針對血清/血漿中外泌體RNA提取新產(chǎn)品，可提取血清/血漿中外泌體中的總RNA。

外泌體相關(guān)產(chǎn)品推薦

參考文獻

[1] Roles of Exosomes in Ocular Diseases.

[2] Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes.

[3] Myogenic Progenitor Cells Control Extracellular Matrix Production by Fibroblasts during Skeletal Muscle Hypertrophy.

[4] Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity.

[5] MLKL,the Protein that Mediates Necroptosis, Also Regulates Endosomal Trafficking and Extracellular Vesicle    Generation.

[6] Prostate cancer-derived urine exosomes: a novel approach to biomarkers for prostate cancer.

[7] Differential protein profiling of renal cell carcinoma urinary exosomes.