mRNA體外合成質(zhì)控要點(diǎn)

自新冠疫情爆發(fā)以來(lái)，疫苗研發(fā)一直是醫藥界密切關(guān)注的對象。到目前為止，被批準進(jìn)入臨床試驗的疫苗類(lèi)型主要包括：滅活疫苗、核酸疫苗、載體疫苗、亞單位疫苗、病毒樣顆粒疫苗和減毒活疫苗。而核酸疫苗中的mRNA疫苗憑借其獨特的優(yōu)勢，迅速在疫苗研發(fā)領(lǐng)域占據一席之地。

mRNA疫苗的優(yōu)勢：

· 導入細胞后表達相應的抗原蛋白，無(wú)需體外蛋白表達、純化過(guò)程。

· 刺激機體免疫系統產(chǎn)生免疫應答。

· 遞送系統具有類(lèi)似佐劑的部分特性，可增強機體的免疫反應。

· 通過(guò)細胞正常代謝完成mRNA的降解，安全性更高。 

mRNA疫苗在多種傳染?。鞲胁《?、埃博拉病毒和寨卡病毒）的臨床研究中已經(jīng)取得一定的研究進(jìn)展，但依然存在一些問(wèn)題，如mRNA本身具有的潛在免疫原性、遞送系統的穩定性、納米劑型安全性及所使用陽(yáng)離子聚合物/脂質(zhì)體安全性等。此外，雖然mRNA疫苗生產(chǎn)規模相對簡(jiǎn)單，但通常采用的是較為復雜的制劑系統，其藥學(xué)研發(fā)和生產(chǎn)控制也更加復雜，因此從疫苗的有效性、安全性和質(zhì)量可控性考慮，mRNA疫苗的質(zhì)量控制就顯得格外重要。

在2020年公布的《新型冠狀病毒預防用mRNA疫苗藥學(xué)研究技術(shù)指導原則（試行）》中，對mRNA疫苗生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量標準做出了明確要求。mRNA的體外合成的生產(chǎn)工藝包括DNA轉錄模板制備、mRNA原液制備、制劑中間產(chǎn)物檢測和成品檢測。

DNA轉錄模板的制備

通常是利用大腸桿菌來(lái)擴增目的基因，隨后進(jìn)行質(zhì)粒純化和模板線(xiàn)性化。此階段關(guān)鍵的質(zhì)控項目包括DNA模板濃度/含量、測序、純度、雜質(zhì)殘留、微生物限度、內毒素等。其中，轉錄模板中的雜質(zhì)殘留可能包括宿主菌DNA、宿主菌RNA、宿主蛋白殘留等，這些殘留會(huì )顯著(zhù)影響體外轉錄的效率，因此需要對模板純度進(jìn)行嚴格的質(zhì)控。

mRNA原液制備

通常采用轉錄模板進(jìn)行mRNA體外轉錄、mRNA加帽、去磷酸化、DNA酶處理、mRNA純化等步驟獲得mRNA原液。mRNA修飾（如修飾核苷的加入）、加Poly(A)尾通常在轉錄過(guò)程中進(jìn)行；加帽可在轉錄過(guò)程中同時(shí)進(jìn)行，也可作為單獨的工藝步驟。此階段關(guān)鍵的質(zhì)控項目包括：加帽率、加Poly(A)尾產(chǎn)物長(cháng)度、mRNA序列完整性、序列準確性、純度、mRNA濃度、產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)（不完整mRNA、截短RNA等）、工藝相關(guān)雜質(zhì)（殘留蛋白、殘留DNA）、無(wú)菌、內毒素等。

制劑中間產(chǎn)物檢測

mRNA的非病毒遞送系統主要包括但不限于基于脂質(zhì)的遞送系統（如核酸脂質(zhì)復合物（lipoplexes）和陽(yáng)離子脂質(zhì)體等）、基于聚合物的載送系統（如polyplexes等）、基于脂質(zhì)和聚合物的載體系統（如lipopolyplexex等）。mRNA包封/裝載的過(guò)程一般系以聚陽(yáng)離子材料或正電荷脂質(zhì)等材料與mRNA復合后直接成粒，或成粒后再經(jīng)包覆形成核殼形結構的過(guò)程。制劑制備過(guò)程還包括后續純化步驟，以去除未包封/裝載的mRNA、游離的聚合物或脂質(zhì)材料和/或包封過(guò)程中引入的有害物質(zhì)?；趍RNA遞送系統制備工藝的實(shí)際情況，對制劑中間產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)控檢測，關(guān)鍵的質(zhì)控項目包括納米顆粒大小及分散系數（PDI）、Zeta電位、正電荷材料相關(guān)雜質(zhì)、不飽和脂質(zhì)的氧化及相關(guān)降解產(chǎn)物、納米顆粒聚集產(chǎn)生的顆粒物、未組裝的脂質(zhì)分子、陽(yáng)離子物質(zhì)、未包封的mRNA等。

成品檢測

 除了上述檢測項目之外，mRNA疫苗還應進(jìn)行體內或體外生物學(xué)活性檢測。研發(fā)早期階段建議根據質(zhì)量研究部分選擇適宜的方法建立體內效力質(zhì)控檢測；必要時(shí)，根據產(chǎn)品的作用機理建立細胞免疫檢測活性的質(zhì)控檢測。

mRNA體外合成質(zhì)控要點(diǎn)總結

疫情當前，國內外許多企業(yè)和機構大量投入研發(fā)，建立mRNA疫苗新型研發(fā)平臺。作為國產(chǎn)生物試劑優(yōu)質(zhì)供應商，全式金為這些企業(yè)提供一系列相關(guān)產(chǎn)品，助力mRNA疫苗研發(fā)。

1. TransStart^? FastPfu Fly DNA Polymerase (AP231)

一種用于快速PCR的熱啟動(dòng)超高保真DNA聚合酶，該酶擴增速度更快 (6 kb/min)，擴增效率更高，產(chǎn)量更高，保真性更高，靈敏度更高。

· 保真性是EasyTaq^? DNA Polymerase的108倍。

· 擴增產(chǎn)物為平端，可直接克隆于pEASY^?-Blunt 系列載體中。

· 基因組DNA 片段的擴增 (≤ 15 kb)。

· Plasmid DNA片段擴增 (≤ 20 kb)。

2. EasyPure^? HiPure Plasmid MaxiPrep Kit (EM121)

利用硅膠膜離心柱特異地吸附DNA，適用于從≤500 ml LB培養基培養的大腸桿菌中高效地提取質(zhì)粒DNA，操作簡(jiǎn)單，提取速度快，DNA純度高。提取的質(zhì)粒DNA適用于酶切、連接、轉化、測序等實(shí)驗。

3. FlyCut^? 系列內切酶

FlyCut^? 系列5分鐘快速內切酶，配有通用的專(zhuān)利性配方的特殊緩沖液，具有省時(shí)、高效（酶切效率高，無(wú)星號活性）的特點(diǎn)。

4. Phi29 DNA Polymerase (LP101)

由重組φ29 DNA polymerase 基因的載體，在大腸桿菌中經(jīng)誘導表達、純化而成, 分子量為74.4 kDa。具有高保真、高效率、高靈敏度、高產(chǎn)量的特點(diǎn)，用于測序、SNP基因分型、STR/微衛星分析、病毒檢測和miRNA檢測。

5. MagicPure^? Size Selection DNA Beads (EC401)

基于Solid Phase Reverse Immobilization (SPRI) 原理，采用具有獨特分離作用的磁珠與緩沖液系統，適用于DNA純化、DNA濃縮、高通量測序文庫構建中DNA片段分選，使用方法可與主流文庫構建試劑盒兼容。

6. DNA文庫構建（轉座酶法/傳統DNA建庫法）

★TransNGS^? Tn5 DNA Library Prep Kit for Illumina^? (for 50 ng/5 ng/1 ng DNA) (KP101/KP121/KP111)

★TransNGS^? DNA Library Prep Kit for Illumina^? (KP201)

7. RNA文庫構建

★TransNGS^? RNA-Seq Library Prep Kit for Illumina^? (KP601)

★TransNGS^? Fast RNA-Seq Library Prep Kit for Illumina^? (KP701)

mRNA原液制備

1. T7 High Efficiency Transcription Kit (JT101)

利用T7 RNA Polymerase，以含有T7啟動(dòng)子的超螺旋質(zhì)粒DNA或線(xiàn)性DNA為模板，對T7啟動(dòng)子下游的DNA序列進(jìn)行高效轉錄。適用于制備長(cháng)度超過(guò)6000 nt的高濃度RNA，制備的RNA可用于體外翻譯、RNase保護實(shí)驗、RNA剪切以及雜交探針標記等。全式金T7 RNA聚合酶轉錄試劑盒在每20 μl體系中，1 μg模板可以生成150-280 μg的RNA。

2. mRNA Capping Kit (LC101)

本產(chǎn)品包含牛痘病毒加帽酶、mRNA帽結構2’-O-甲基轉移酶和其他加帽反應組分，可用于對T7體外轉錄(JT101)產(chǎn)生的RNA進(jìn)行5’加帽修飾，具有高效、高靈活性、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。反應產(chǎn)物為Cap1-mRNA，加帽效率可接近100%，并且帽子結構方向正確，對于mRNA的穩定、轉運（出核）、翻譯過(guò)程均有重要作用。

3. mRNA Poly(A) Tailing Kit (LA201)

本產(chǎn)品反應時(shí)不依賴(lài)模板的存在，催化ATP轉化為AMP并依次摻入到RNA的3’末端，即在mRNA的3’末端加Poly(A) 尾，提高RNA在細胞中的穩定性。本產(chǎn)品具有很高的加尾效率，且可平行放大體系用于在體外轉錄(JT101)及加帽后(LC101) mRNA的加尾修飾，制備可用于細胞轉染的RNA樣品。具有高效率、高靈活性、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。

4. MagicPure^? mRNA Kit (EC511)

偶聯(lián)了Oligo (dT)的磁珠與帶Poly(A)尾的mRNA特異結合，純化后的mRNA純度高，完整性好，得到的mRNA適用于RT-PCR、qRT-PCR、二代測序等。本試劑盒適用于磁棒式高通量核酸提取儀。

5. EasyPure^? RNA Purification Kit (ER701)

利用硅膠膜離心柱特異地吸附RNA，純化經(jīng)DNase I處理的總RNA產(chǎn)物、體外轉錄產(chǎn)物、RNA標記產(chǎn)物、合成RNA等，能有效地去除蛋白質(zhì)、有機化合物、無(wú)機鹽離子等雜質(zhì)，操作簡(jiǎn)便、快速。

6. MagicPure^? RNA Beads (EC501)

利用獨特的磁珠與緩沖液系統，特異地吸附RNA，純化去除rRNA的RNA產(chǎn)物，經(jīng)DNase I處理的RNA產(chǎn)物，純化體外轉錄產(chǎn)物、RNA標記產(chǎn)物和合成RNA等。操作簡(jiǎn)便、快速。

自動(dòng)核酸提取儀

TS-32/96自動(dòng)核酸提取儀是采用先進(jìn)磁珠分離技術(shù)的高科技產(chǎn)品，具有自動(dòng)化程度高，提取速度快，結果穩定，操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。全式金作為國內知名的核酸分離純化技術(shù)公司，可提供多種配套提取試劑盒，使儀器的使用范圍最大化，成本低廉化。

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參考文獻

[1] 新型冠狀病毒預防用mRNA疫苗藥學(xué)研究技術(shù)指導原則（試行）