2024 諾貝爾生理學(xué)或醫學(xué)獎：microRNA 開(kāi)啟基因調控新維度

2024 年諾貝爾生理學(xué)或醫學(xué)獎的頒布，再次吸引了全球科學(xué)界的目光。今年，這一殊榮授予了兩位科學(xué)家：Victor Ambros和Gary Ruvkun，他們因發(fā)現microRNA及其在基因轉錄后調控的作用，獲得2024年諾貝爾生理學(xué)或醫學(xué)獎。

圖1 2024年諾貝爾生理學(xué)或醫學(xué)獎獲獎?wù)?，Victor Ambros和Gary Ruvkun

microRNA 的發(fā)現過(guò)程

故事要從 20 世紀 80 年代末說(shuō)起，Ambros和Ruvkun一直在研究秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)（現在都已成為模式生物了）的生命進(jìn)程，他們將目標鎖定在了兩個(gè)突變株 “l(fā)in-4” 和 “l(fā)in-14”上。Ambros驚奇地發(fā)現，lin-4 基因仿佛是 lin-14 基因的神秘 “負調控者”，但其中的抑制機制卻如同籠罩在一層迷霧之中，讓人捉摸不透。

時(shí)光流轉，Ambros直到博士后生涯結束，才在哈佛大學(xué)的實(shí)驗室里意外迎來(lái)了重大突破。他發(fā)現，lin-4 基因抑制 lin-14 基因的原因，極有可能是 lin-4 產(chǎn)生的一種超短 RNA。與此同時(shí)，Ruvkun也有了驚人發(fā)現，他察覺(jué)到 lin-4 并不影響 lin-14 基因產(chǎn)生mRNA，而是阻止 mRNA 產(chǎn)生蛋白質(zhì)。并且，他還找到了 lin-14轉錄mRNA 上的一個(gè)關(guān)鍵位置，這個(gè)位置就是 lin-4 對其進(jìn)行抑制的結合位點(diǎn)。

當Ambros和Ruvkun交流彼此的發(fā)現后，一個(gè)具有突破性的結論誕生了：lin-4 中的超短 RNA 與 lin-14 中 mRNA 的關(guān)鍵片段序列互補，正是通過(guò)這種奇妙的結合，超短 RNA 如同一個(gè)“開(kāi)關(guān)”，“關(guān)閉”了 lin-14基因的表達，阻止它產(chǎn)生蛋白質(zhì)。這一發(fā)現，揭開(kāi)了以前從未被知曉的、基于 microRNA 的基因調控機制。因為在此之前，科學(xué)家們一直認為是一種名為 “轉錄因子” 的特殊蛋白質(zhì)，通過(guò)與 DNA 的特定區域結合，來(lái)決定產(chǎn)生哪些 mRNA，從而實(shí)現基因調控。

圖2  Ambros和Ruvkun發(fā)現lin-4來(lái)源的microRNA過(guò)程

如今，人體內超過(guò)一千種 microRNA 已被發(fā)現?？梢院敛豢鋸埖卣f(shuō)，沒(méi)有它們，細胞和組織就無(wú)法正常發(fā)育，而它們的異常和突變甚至可能引發(fā)癌癥等嚴重疾病。microRNA 的出現，就像是為生命的基因調控世界打開(kāi)了一扇全新的大門(mén)，揭示了一個(gè)全新的維度，它對所有復雜的生命形式都至關(guān)重要。

圖4 自1993-2000發(fā)現microRNA開(kāi)始的microRNA研究進(jìn)程

microRNA 的應用

近些年來(lái)由于對microRNA研究的比較多，我們知道microRNA 是一類(lèi)由內源基因編碼的長(cháng)度約為 22 個(gè)核苷酸的非編碼單鏈 RNA 分子。它通過(guò)與靶 mRNA 結合，抑制其翻譯或促進(jìn)其降解，從而在轉錄后水平調控基因表達。

圖5 microRNA的開(kāi)創(chuàng )性發(fā)現揭示了基因調控的一個(gè)新維度

醫學(xué)領(lǐng)域

在醫學(xué)領(lǐng)域，microRNA 展現出了巨大的潛力，可作為疾病的重要生物標志物。例如，眾多研究已表明，在某些癌癥中，特定的 microRNA 表達水平會(huì )發(fā)生顯著(zhù)變化。Lan 等人在權威期刊《Biomedical Research International》發(fā)表的論文中深入探討并強調了 microRNA 作為癌癥潛在生物標志物的重大意義。以肝癌為例，大量研究發(fā)現，在不同類(lèi)型的癌癥（肺癌、肝癌、結直腸癌等）患者中，不同的microRNA的表達水平有非常明顯的變化。通過(guò)對血液中microRNA含量的精準檢測，能夠為癌癥的早期診斷提供極為重要的參考依據。

同時(shí)，microRNA 為疾病治療開(kāi)辟了新的策略。Krützfeldt 等人在國際著(zhù)名期刊《Nature》發(fā)表的研究中，創(chuàng )新性地介紹了 “antagomirs” 這種反義寡核苷酸，它可在體內有效地沉默 microRNA。通過(guò)使用特定的 microRNA 模擬物或抑制劑，可以精準地調節相關(guān)基因的表達，進(jìn)而為疾病治療帶來(lái)新的希望。在一些癌癥的治療研究中，科學(xué)家們積極探索使用 microRNA 抑制劑來(lái)抑制腫瘤細胞的生長(cháng)和擴散。例如，針對某些特定類(lèi)型的癌癥，研究人員發(fā)現特定的 microRNA 抑制劑能夠靶向作用于腫瘤細胞中的關(guān)鍵基因，從而抑制腫瘤細胞的增殖和轉移，為癌癥治療提供了新的思路和方法。

農業(yè)領(lǐng)域

在農業(yè)領(lǐng)域，microRNA 在植物的生長(cháng)發(fā)育和抗逆性中起著(zhù)至關(guān)重要的作用。Tang 和 Chu 在《Nature Plants》發(fā)表的文章中，系統地強調了 microRNA 在作物復雜性狀改良中的重要意義。通過(guò)調控植物中的 microRNA 表達，可以有效地改良農作物的品質(zhì)和產(chǎn)量。比如，在面對干旱、鹽堿等不良環(huán)境時(shí)，調節與植物抗逆性相關(guān)的 microRNA，可以顯著(zhù)提高農作物的耐受性。此外，還可以利用 microRNA 技術(shù)來(lái)培育具有特定性狀的轉基因農作物。Zhou 和 Luo 的研究深入探討了 microRNA 介導的基因調控在植物基因工程中的潛在應用。通過(guò)對特定 microRNA 的調控，可以實(shí)現對農作物生長(cháng)發(fā)育過(guò)程的精準干預，培育出具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆等優(yōu)良性狀的農作物品種，為農業(yè)生產(chǎn)的可持續發(fā)展提供了新的技術(shù)手段。

研究方法

那么如何研究 microRNA 呢？ 常用的實(shí)驗方法和技術(shù)手段也是豐富多樣的，下面跟大家介紹一些常用的實(shí)驗研究方法。

① Northern Blot

這是一種經(jīng)典的 RNA 檢測方法。通過(guò)電泳將 RNA 分離，然后將其轉移到膜上，利用特定的 microRNA 探針進(jìn)行雜交，檢測 microRNA 的表達水平。雖然該方法相對較為繁瑣，但具有較高的特異性和準確性。

圖6 Northern Blot檢測的靈敏度和準確性

② 基因芯片技術(shù)

這是一種高通量的檢測方法，可以同時(shí)檢測大量 microRNA 的表達水平。通過(guò)將已知的 microRNA 探針固定在芯片上，與樣本中的 microRNA 進(jìn)行雜交，然后利用熒光或其他信號檢測技術(shù)，快速獲取樣本中 microRNA 的表達譜。這種方法能夠全面地了解不同生理或病理狀態(tài)下 microRNA 的變化情況，為研究 microRNA 的功能提供重要線(xiàn)索。這種方法成本較高；可能存在假陽(yáng)性和假陰性結果；對樣本的質(zhì)量和數量要求較高。

③ 實(shí)時(shí)定量 PCR（RT-qPCR）

該方法可用于特定 microRNA 的定量分析。它具有高靈敏度和特異性，能夠準確地檢測出微量的 microRNA。通過(guò)設計針對特定 microRNA 的引物和探針，利用 PCR 技術(shù)對 microRNA 進(jìn)行擴增，并實(shí)時(shí)監測擴增過(guò)程中的熒光信號變化，從而計算出 microRNA 的相對或絕對表達量。由于其操作相對方便，方法簡(jiǎn)單，通量高，已經(jīng)成為實(shí)驗室里面常用的一種檢測microRNA的方法了。

這種方法首先要把 RNA 提取出來(lái)，microRNA 的 qPCR 的檢測與正常的基因無(wú)明顯差異，但由于 microRNA 比較小，所以需要的特殊的反轉錄方法。常用的反轉錄方法有兩種，一種為莖環(huán)法（Stemloop specific primer），一種為加尾法（Universal primer）。

圖7 microRNA常見(jiàn)的2種反轉錄的方式

④ RNA 干擾技術(shù)

這是一種研究 microRNA 功能的有力工具。通過(guò)導入特定的小干擾 RNA（siRNA）或 microRNA 抑制劑，可以特異性地抑制目標 microRNA 的功能。相反，使用 microRNA 模擬物可以增強 microRNA 的活性。通過(guò)觀(guān)察細胞或生物體在 microRNA 功能改變后的表型變化，可以推斷出 microRNA 的生物學(xué)功能。

⑤ 生物信息學(xué)分析

隨著(zhù)高通量測序技術(shù)的發(fā)展，產(chǎn)生了大量的 microRNA 序列數據。生物信息學(xué)方法可以用于分析這些數據，預測新的 microRNA、識別 microRNA 的靶基因以及研究 microRNA 的進(jìn)化和功能保守性。例如，利用序列比對算法，可以在不同物種中尋找保守的 microRNA，從而揭示 microRNA 在進(jìn)化過(guò)程中的重要作用。

⑥ 細胞和動(dòng)物模型實(shí)驗

構建細胞和動(dòng)物模型是研究 microRNA 功能的重要手段。通過(guò)在細胞系中過(guò)表達或抑制特定的 microRNA，可以觀(guān)察細胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過(guò)程的變化。在動(dòng)物模型中，可以通過(guò)基因敲除、轉基因等技術(shù)來(lái)研究 microRNA 在體內的功能。例如，構建 microRNA 敲除小鼠模型，可以研究特定 microRNA 在小鼠發(fā)育、生理和疾病中的作用。

圖8 整體原位microRNA 雜交（Whole-mount miRNA ISH）技術(shù)在生物發(fā)育中的應用

⑦ microRNA 活性檢測方法

? 報告基因法：構建含有 microRNA 靶序列和報告基因（如熒光素酶基因）的載體，當 microRNA 與靶序列結合時(shí)，會(huì )抑制報告基因的表達。通過(guò)檢測報告基因的活性變化，可以間接反映 microRNA 的活性。其中熒光素酶報告系統由于操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，已廣泛的應用于microRNA的活性及靶標檢測。更詳細的方法可以參看下方的視頻。

復制下方鏈接，可查看完整視頻

http://www.hailunguo.com/technology_video.html

? Western blot 檢測靶蛋白法：microRNA 通過(guò)與靶 mRNA 結合抑制其翻譯，從而降低靶蛋白的表達水平。通過(guò) Western blot 技術(shù)檢測靶蛋白的表達量變化，可以推斷 microRNA 的活性。

? RNA 結合蛋白免疫沉淀法（RIP）：利用抗體特異性地結合與 microRNA 結合的 RNA 結合蛋白，然后通過(guò)免疫沉淀分離出與該蛋白結合的 RNA，包括 microRNA 和其靶 mRNA。通過(guò)檢測沉淀下來(lái)的 RNA 中 microRNA 和靶 mRNA 的含量，可以分析 microRNA 的活性及其與靶 mRNA 的結合情況。

TransGen 相關(guān)產(chǎn)品

EasyPure^? miRNA Kit

小 RNA 提取試劑盒 (ER601)

產(chǎn)品特點(diǎn)

★ 操作安全性提高：使用 RNA Extraction Agent 替代了氯仿

★ 適用于從細胞、組織、新鮮血液、外泌體中提取 miRNA 和 Total RNA

★ 通過(guò)調整加入水相中無(wú)水乙醇的用量，可獲得：

1. RNA 離心柱吸附大分子量 RNA(28S rRNA, 18S rRNA, mRNA) 后，將流出液 ( 包含小于 200 nt 的 RNAs, 如 miRNA,siRNA, shRNA, snRNA 等 ) 再經(jīng) miRNA 離心柱吸附 Small RNA；

2. RNA 離心柱吸附所有 RNA( 包含小于 200 nt 的 RNA)

★ 裂解能力強、提取量高、應用范圍廣

數據展示

分別用 miRNA 提取產(chǎn)品提取 miRNA，2 個(gè)重復，用 miRNA 反轉錄產(chǎn)品反轉后進(jìn)行 qPCR 檢測

TransZol Up

強化 RNA 提取試劑盒 (ET111)

產(chǎn)品特點(diǎn)

與其它總 RNA 提取試劑相比，裂解能力強、速度快，RNA 的提取量與純度更高。

? 操作安全性提高：使用 RNA Extraction Agent 替代了氯仿

? 適用于快速提取多種組織和細胞中的總 RNA

? 應用范圍廣：動(dòng)物、植物組織、血液和細菌等樣品。小量樣品 (50-100 mg 組織、5×106 細胞、200 μL 血液 )。大量樣品 ( ≥1 g 組織或 ≥107 細胞 )

? 提取速度快：一個(gè)小時(shí)內可完成反應

? 操作可視化：溶液呈粉紅色，便于分離水相和有機相

? 提取純度高：DNA 和蛋白質(zhì)的污染低

? RNA 溶解液：便于 RNA 保存和降低對反轉錄反應的抑制

數據展示

TransScript^? miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix

TransScript miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒 (AT351)

產(chǎn)品特點(diǎn)

★ 適用于 Total RNA 或 small RNA 等包含 miRNA 的樣品反轉錄

★ 優(yōu)化的加尾酶和反轉錄酶配比及反應緩沖液，確保 miRNA 的反轉錄效率

★ Poly(A) 加尾和 cDNA 合成在同一反應體系中一步完成

數據展示

? 批次間穩定性好

使用不同批次產(chǎn)品分別以從人血漿中提取的 miRNA 為模板，進(jìn)行 qRT-PCR 檢測，根據 Cq 值變化判斷該產(chǎn)品批次間的穩定性。

? 反轉錄效率高

使用 TransGen 和 Company TA 產(chǎn)品，分別以從人血漿中提取的miRNA 為模板，進(jìn)行 qRT-PCR 檢測，根據 Cq 值變化分析反轉錄效果。

TransScript^? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix

TransScript 一步法 gDNA 去除及 cDNA 合成試劑盒 (AT311)

產(chǎn)品特點(diǎn)

★ 在同一反應體系中，同時(shí)完成反轉錄與基因組 DNA 的去除，操作簡(jiǎn)便，降低污染幾率

★ 產(chǎn)物用于 qPCR：反轉錄 15 分鐘；產(chǎn)物用于 PCR：反轉錄 30 分鐘

★ 反應結束后，同時(shí)熱失活 RT/RI 與 gDNA Remover

★ 合成片段 ≤12 kb

數據展示

? 反轉錄效率高

? 高效基因組去除

使用不同批次產(chǎn)品分別以人 100 ng 總 RNA、人 100 ng 總 RNA+200 ng gDNA、200 ng gDNA 為模板，進(jìn)行 RT-PCR 檢測，1.0% 瓊脂糖凝膠電泳分析模板 DNA 去除效果；qRT-PCR 檢測 18S DNA 表達量。

PerfectStart^? Green qPCR SuperMix

染料法熒光定量預混試劑（AQ601）

產(chǎn)品特點(diǎn)

★ 3 種抗體封閉，特異性高，靈敏度高，擴增效率強，適用物種范圍廣

★ 雙陽(yáng)離子緩沖液，增強特異性，減少引物二聚體形成，數據準確

★ 配有適用于不同機型的 Universal Passive Reference Dye ( 調整 PCR 加樣誤差引起的管間差異 )，校正孔間信號誤差

數據展示

? 擴增效率高

以梯度稀釋的質(zhì)粒 DNA (10 ng ～ 0.1 pg，10 倍稀釋 ) 為模板進(jìn)行擴增得到的擴增曲線(xiàn)和標準曲線(xiàn)。結果顯示，TransGen 產(chǎn)品擴增效率較高，可得到漂亮的擴增曲線(xiàn)和標準曲線(xiàn)。

? 不同物種模板擴增

以不同物種的 RNA 反轉錄 (TransGen, AT311) 后得到的 cDNA 為模板分別使用 TransGen 與 Company T 的產(chǎn)品進(jìn)行擴增 (NTC 無(wú)擴增 )。結果顯示，TransGen 產(chǎn)品擴增效果與 Company T 產(chǎn)品基本一致。

產(chǎn)品信息

精選文獻

? Duan H J, Chu H Q, Cao T M, et al. Investigation of the cell composition and gene expression in the delayed-type hypersensitivity tuberculin skin test[J]. Military Medical Research, 2023. 使用產(chǎn)品TransZol Up (ET111)

? Wang D, Xu C, Yang W, et al. E3 ligase RNF167 and deubiquitinase STAMBPL1 modulate mTOR and cancer progression[J]. Molecular cell, 2022. 使用產(chǎn)品TransZol Up (ET111)

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? Huang R, Jia B, Su D, et al. Plant exosomes fused with engineered mesenchymal stem cell‐derived nanovesicles for synergistic therapy of autoimmune skin disorders[J]. Journal of Extracellular Vesicles, 2023. 使用產(chǎn)品TransScript^? miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix

? Zhao J, Zeng X, Liu J, et al. Marasmius androsaceus mitigates depression-exacerbated intestinal radiation injuries through reprogramming hippocampal miRNA expression[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2023. 使用產(chǎn)品TransScript^? miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix

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展望

對 microRNA 的未來(lái)研究充滿(mǎn)期待。在研究方向上，科學(xué)家們將進(jìn)一步深入探索 microRNA 在不同生理和病理過(guò)程中的作用機制，以及與其他基因調控因子的相互關(guān)系。在疾病治療方面，有望開(kāi)發(fā)出基于 microRNA 的新型藥物，為癌癥等嚴重疾病的治療帶來(lái)新的突破。同時(shí)，隨著(zhù)技術(shù)的不斷進(jìn)步，對 microRNA 的檢測和調控方法也將更加精準和高效。

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