多平臺、多方法DNA文庫制備

自DNA被證明是生命體的遺傳物質(zhì)以來(lái)，科學(xué)家們對DNA的探索熱情愈加高漲。1953年沃森和克里克發(fā)現DNA分子雙螺旋結構，讓人類(lèi)對生命的認識有了重大的突破，從而帶動(dòng)了DNA測序技術(shù)的大發(fā)展。

● DNA測序技術(shù)的發(fā)展里程碑

從1977年第一代測序技術(shù)（Sanger法）到2005年Roche公司推出第一臺基于焦磷酸測序的二代測序儀開(kāi)始，到2017年Illumina推出NovaSeqTM系列，再到2018年MGISEQ-T7超高通量測序儀，測序技術(shù)至今已經(jīng)歷了四十多年的技術(shù)發(fā)展過(guò)程。

注：圖片來(lái)源于網(wǎng)絡(luò )

● 二代測序技術(shù)平臺

第二代測序技術(shù)也叫高通量測序技術(shù)（NGS），其核心原則是邊合成邊測序。二代測序主要特點(diǎn)是一次能對幾十萬(wàn)甚至幾百萬(wàn)條DNA序列進(jìn)行同時(shí)測定，使轉錄組測序及基因組深度測序變得高效、便捷，在保持高準確性的同時(shí)降低了測序成本，提高了測序的速度；但其測序的理論基礎仍然建立在PCR擴增的基礎之上，從而會(huì )引入PCR擴增帶來(lái)的偏差，而且讀長(cháng)較短的缺點(diǎn)?，F有的技術(shù)平臺主要包括Illumina公司的Hiseq平臺、Thermo fisher公司的Ion Torrent平臺和華大MGISEQ平臺，其中市場(chǎng)占比中illumina測序儀在全球的占有率高達83.9%。

illumina測序原理（來(lái)源：illumina官網(wǎng)）

隨著(zhù)高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展，對測序質(zhì)量和通量的要求越來(lái)越高，二代測序主要包括文庫構建、上機測序、數據輸出這幾個(gè)流程。其中，DNA文庫構建是二代測序技術(shù)的基礎，高效簡(jiǎn)潔的建庫方法可以提高整個(gè)測序流程的效率，其基本原理就是將待測樣本片段化成小片段，再在其兩端加上接頭。根據樣本片段化方式及添加接頭方式的不同，常見(jiàn)的建庫方式有以下幾種：

常規法DNA建庫

傳統DNA建庫具有適用樣品類(lèi)型廣泛，文庫轉化率高的特點(diǎn)，是目前較常用的DNA二代測序文庫構建方法。該方法主要通過(guò)TA克隆的方式連接接頭，具體建庫流程如下：

? 待測序DNA片段化

? 片段化的DNA進(jìn)行末端修復和加A尾

? 修復后的片段進(jìn)行接頭連接

? 文庫擴增

全式金目前已推出2款分別適用于Illumina和MGI平臺的傳統文庫構建試劑盒，適用于全基因組、靶基因、宏基因組等多種測序。

? TransNGS^? DNA Library Prep Kit for Illumina^?

該產(chǎn)品針對Illumina 高通量測序平臺開(kāi)發(fā)，適用于將1 ng-1 μg 片段化的dsDNA 高效快速地轉化為測序文庫，具有文庫轉化效率高，適用樣本類(lèi)型廣泛的特點(diǎn)。

● 文庫構建原理示意圖

● 與競品的比較

? 不同起始樣品量文庫產(chǎn)量比較

分別使用TransGen和Company K產(chǎn)品，對來(lái)源于人血的不同起始量基因組DNA片段化后的dsDNA進(jìn)行建庫，結果表明，TransGen產(chǎn)品對1 ng-1 μg起始樣品量均有較高的建庫效率。

? 測序結果比較

分別使用TransGen和Company K產(chǎn)品，對100 ng來(lái)源于人血、人肺FFPE樣品和水稻葉片三種基因組DNA片段化后的dsDNA進(jìn)行建庫測序及分析，結果表明，TransGen產(chǎn)品在數據質(zhì)量、GC分布及相關(guān)性方面與競品相比，性能一致。

? 測序數據質(zhì)量

? GC分布

? 染色體覆蓋深度分布

? SNP分析

? 相關(guān)性分析

? TransNGS^? DNA Library Prep Kit for MGI^?

該產(chǎn)品是針對MGI 高通量測序平臺開(kāi)發(fā)的文庫試劑盒，具有文庫轉化效率高，適用樣本類(lèi)型廣泛，數據質(zhì)量高的特點(diǎn)。

● 文庫構建原理示意圖

● 與競品的比較

? 不同起始樣本量文庫產(chǎn)量比較

分別使用TransGen和Company V產(chǎn)品，對來(lái)源于人HeLa細胞的不同起始量基因組DNA片段化后的dsDNA進(jìn)行相同循環(huán)數的建庫。結果表明，TransGen產(chǎn)品對1 ng-1 μg起始樣本量均有較高的建庫效率。

? 測序結果比較

分別使用TransGen和Company V產(chǎn)品，對來(lái)源于人Hela細胞的不同起始量基因組DNA片段化后的dsDNA進(jìn)行建庫測序及分析。 結果表明，TransGen產(chǎn)品在數據質(zhì)量、GC分布及相關(guān)性方面與競品相比，性能一致。

? 測序結果比較

? GC分布

? 染色體覆蓋深度分布

? SNP分析

? 相關(guān)性分析

轉座酶法建庫

與傳統文庫制備必須進(jìn)行DNA片段化、末端修復和接頭連接相比，體外轉座技術(shù)不僅快速、操作簡(jiǎn)便，而且建庫所需DNA量少，5分鐘內即可同時(shí)完成DNA片段化和接頭連接。

針對不同的起始量樣品，全式金推出3款Tn5建庫產(chǎn)品

? TransNGS^? Tn5 DNA Library Prep Kit for Illumina^? (for 50 ng DNA)

? TransNGS^? Tn5 DNA Library Prep Kit for Illumina^? (for 5 ng DNA)

? TransNGS^? Tn5 DNA Library Prep Kit for Illumina^? (for 1 ng DNA)

● 文庫構建原理示意圖

●產(chǎn)品穩定性

以5 ng人基因組DNA為樣品，分別使用不同批次產(chǎn)品構建全基因組短片段文庫，擴增9個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物經(jīng)1.0×DNA磁珠（TransGen, EC411）純化（不進(jìn)行文庫片段長(cháng)度分選），文庫經(jīng)Agilent高靈敏DNA芯片鑒定，片段長(cháng)度分布一致，主要分布在200-2000 bp之間 ；使用Qubit檢測文庫濃度，計算文庫產(chǎn)量。由峰型的一致性與產(chǎn)量的一致性上可知，產(chǎn)品批次間的穩定性好。

?文庫峰型與產(chǎn)量

● 與競品的比較

以5 ng人基因組DNA為樣品，分別使用TransGen和Company V產(chǎn)品構建全基因組短片段文庫并進(jìn)行文庫測序及分析，結果表明，TransGen 產(chǎn)品在文庫峰型與產(chǎn)量、測序數據質(zhì)量、GC 分布與相關(guān)性方面與競品相比，性能一致。

? 文庫峰型與產(chǎn)量

? 測序數據質(zhì)量

?GC分布

? 相關(guān)性分析

片段化酶法建庫

相對于超聲打斷法，片段化酶法打斷操作更為簡(jiǎn)單，轉管次數更少，樣本損耗量也更低，可以兼容更低的樣本起始量。最重要的是，酶解法打斷不需要使用專(zhuān)門(mén)的儀器和耗材，能大幅降低建庫成本，因此全式金最新推出了2款適用于Illumina和MGI平臺的片段化酶法建庫試劑盒。

? TransNGS^? Fragmentase DNA Library Prep Kit for Illumina^?

該產(chǎn)品適用于將起始量為1 ng-1 μg的dsDNA高效快速地構建成DNA文庫，一步完成DNA片段化、末端修復以及末端加A反應，產(chǎn)物無(wú)需純化，可直接用于接頭連接。

● 文庫構建原理示意圖

●不同起始樣本量文庫產(chǎn)量比較

使用TransGen產(chǎn)品，以1 ng、10 ng、100 ng和500 ng起始量Hela細胞基因組DNA為模板，采用UDI長(cháng)接頭（TransGen, KI341）進(jìn)行酶切法DNA文庫構建，結果表明，文庫產(chǎn)量均在1 μg左右。

● 不同物種樣本文庫產(chǎn)量

使用TransGen產(chǎn)品，對玉米、金黃色葡萄球菌、土壤微生物等不同類(lèi)型樣本進(jìn)行建庫，結果表明，文庫產(chǎn)量均在1 μg左右。

● 測序結果比較

使用TransGen產(chǎn)品，以1 ng、10 ng、100 ng 和500 ng起始量Hela細胞基因組DNA為模板，采用UDI長(cháng)接頭（TransGen, KI341）進(jìn)行酶切法DNA文庫構建及分析。結果表明，TransGen產(chǎn)品對1 -500 ng起始量樣本均可高效建庫。

? 測序數據質(zhì)量

? 堿基含量分布

? GC 分布

? TransNGS^? Fragmentase DNA Library Prep Kit for MGI^?

該產(chǎn)品適用于將起始量為1 ng-1 μg的dsDNA高效快速地構建成DNA文庫，一步完成DNA片段化、末端修復以及末端加A反應，產(chǎn)物無(wú)需純化，可直接用于接頭連接。

● 文庫構建原理示意圖

● 與競品的比較

分別使用TransGen和Company I產(chǎn)品，對200 ng人基因組標準品NA12878進(jìn)行酶切法DNA文庫構建，結果表明，TransGen產(chǎn)品在測序數據質(zhì)量、比對率、SNP和InDel檢出方面與競品相比，性能一致。

? 測序數據質(zhì)量

? SNP及InDel檢出

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