Q：如何選擇合適的克隆載體？

A：Taq系列酶擴增的片段，選用T載體；Pfu系列酶擴增片段，選用Blunt系列載體，也可以加“A”后和T載體連接，但效果不如直接連接Blunt系列載體。如果PCR模板是質(zhì)粒DNA，推薦使用雙抗性載體。

Q：插入片段的量多少合適？

A：

? 片段加入量可根據片段長(cháng)度不同進(jìn)行調整。 最佳插入片段DNA量：載體與片段摩爾比=1:7

? 可以粗略的按照“1 kb 20 ng”的比例計算。(如1 kb加20 ng，1.5 kb加30 ng等)、(在膠上通過(guò)TransGen的DNA 分子量標準粗定量即可)

? 片段加入量最大為4μl，即使片段濃度很低也不要超過(guò)此限。片段加入量最少為0.5μl，可以補充無(wú)菌水以方便操作。

? 反應溫度范圍：20-37℃，最適反應溫度為25℃。

Q：反應時(shí)間多長(cháng)合適？

A：

? 大多數1 kb以?xún)鹊腜CR產(chǎn)物室溫反應5分鐘即可完成反應。以下幾種情況可以延長(cháng)反應時(shí)間以獲得更理想的效果：

? 具有特殊結構(高AT/高GC/反向重復序列)的片段：10-20分鐘。

? 膠回收片段或加"A"片段：10-15分鐘(該條件適用于3 kb以?xún)鹊钠?。

? 大于3 kb的PCR產(chǎn)物需延長(cháng)至15-20分鐘。

Q：連接產(chǎn)物可以保存多久？

A：連接產(chǎn)物可以置于-20℃或2-8℃冰箱，一周內使用。

Q：多克隆位點(diǎn)上的酶切位點(diǎn)切不開(kāi)？

A：篩選到的克隆來(lái)源于模板質(zhì)粒而不是連接產(chǎn)物。推薦使用雙抗載體，篩選時(shí)使用模板質(zhì)粒不具有的抗性。

Q：克隆數少或陽(yáng)性率低？

A：

? 影響克隆數目和克隆效率的因素有許多，如感受態(tài)細胞效率、插入片段質(zhì)量、基因結構、插入片段長(cháng)度、插入片段和載體的比例等。如發(fā)現克隆數少或克隆效率低，可嘗試下列方法：

? 感受態(tài)細胞的轉化效率對克隆數有重要影響，轉化效率高低與連接產(chǎn)物克隆數的多少不呈線(xiàn)性關(guān)系。假設細胞轉化效率為1×109 cfu/μg DNA時(shí)，克隆數為1000；轉化效率為1×108 cfu/μg DNA時(shí)，克隆數并不是100，而是低于100。為保證克隆數，請選用高轉化效率的Trans1-T1感受態(tài)細胞。

? 使用新鮮的PCR產(chǎn)物：PCR產(chǎn)物于2-8℃保存，1-2天內使用。對于膠回收產(chǎn)物，應盡量縮短紫外照射時(shí)間并適當延長(cháng)反應時(shí)間 (10-15分鐘)。

? 目的片段濃度極低時(shí)，進(jìn)行濃縮，以保證反應時(shí)分子碰撞機率。

? 毒基因：使用Trans10感受態(tài)細胞。

? 具有特殊結構 (高AT/高GC/反向重復序列) 的基因：適當延長(cháng)反應時(shí)間至10-20分鐘。

Q：PCR鑒定重組子失??？

A：當用通用引物鑒定重組子，沒(méi)有得到目的擴增產(chǎn)物，又沒(méi)有載體自連帶，說(shuō)明PCR失敗。重新優(yōu)化PCR條件或提取質(zhì)粒，以質(zhì)粒作模板擴增或酶切鑒定包含重組子的克隆。

Q：重組克隆呈現淡藍色或“Fish eye”？

A：插入片段沒(méi)有影響LacZ基因讀碼框，或插入片段太短 ，這種情況下克隆呈現淡藍色或“Fish eye”，可正常鑒定。