Q：Passive Reference Dye的作用是什么，如何使用？
A：它們是針對不同機器型號校正加樣管間誤差的參比熒光染料。它們的濃度為50×，使用時(shí)在20μl體系中加入0.4μl即可。
Q：CT值出現過(guò)晚？
A：可能是擴增效率低，反應條件不夠優(yōu)化。此外PCR各種反應成分的降解或者PCR產(chǎn)物太長(cháng) (一般采用80-250 bp的產(chǎn)物長(cháng)度) 也會(huì )造成CT值出現過(guò)晚。
Q：qPCR SuperMix是否需要調整Mg2+濃度？
A：一般不需要調整，當PCR結果不理想或通過(guò)其它調整不能獲得明顯改善時(shí)，可以考慮通過(guò)調整Mg2+濃度以改進(jìn)擴增結果。
Q：擴增曲線(xiàn)異常？
A：
? 基線(xiàn)設置有誤。
? 高濃度的模板會(huì )導致CT值過(guò)早出現，即基線(xiàn)范圍變小，導致機器讀取熒光數值有誤。
Q：重復性差？
A：
? 操作誤差。
? 模板濃度過(guò)低會(huì )導致重復性變差，可適當提高模板濃度，降低稀釋倍數。
? 機器本身的孔間溫度不一致。
Q：NTC不為零，如何優(yōu)化？
A：
? 提高退火溫度。
? 降低引物工作濃度，如需要可降至60 nM。
? 盡量在冰上操作。
? 重新設計引物，必要時(shí)可設計多對引物，優(yōu)中選優(yōu)。
