Q：RNase H活性對反轉錄反應的影響？
A：RNase H活性能夠催化降解DNA/RNA 雜交體中的RNA。RNase H活性缺失避免了第一鏈cDNA 合成反應中DNA/RNA 雜交體中模板RNA被降解，從而保證第一鏈cDNA 的合成量和長(cháng)度。
Q：不同溫度下的反轉錄反應有何差別？
A：一般的反轉錄酶的適宜反應溫度是42℃，但是對于某些GC含量高的基因或二級結構復雜的基因，在42℃不足以打開(kāi)二級結構，使cDNA合成無(wú)法順利進(jìn)行。此時(shí)需要用耐高溫的反轉錄酶，如TransScript ? II RT或TransScript ?-Uni RT，在高溫 (≤55℃或≤65℃)條件下進(jìn)行反轉錄以獲得較好的結果。
Q：RT-PCR后，無(wú)PCR產(chǎn)物的原因？
A：在反轉錄反應前一定要電泳驗證RNA的完整性，確認RNA沒(méi)有降解。RNA不要保存時(shí)間過(guò)長(cháng)，盡快進(jìn)行反轉錄及PCR操作。
Q：基因克隆測序后經(jīng)常發(fā)生突變的原因？
A：從cDNA進(jìn)行基因克隆時(shí)，突變有可能發(fā)生在反轉錄過(guò)程，也可能發(fā)生在PCR過(guò)程中。一般用保真性高的Taq酶或者Pfu酶進(jìn)行擴增，循環(huán)數不要太高；可通過(guò)增加模板量、減少循環(huán)數降低突變機率。為保證反轉錄時(shí)的保真性，請選擇保真性高的反轉錄酶。
Q：RT-PCR時(shí)模板一般使用多少？
A：反轉錄反應體系為20μl時(shí)，用50 ng-5μg /5-500 ng Total RNA/mRNA進(jìn)行反轉錄，RT-PCR用1/20-1/10 PCR體積 (2.5-5μl) 的反轉錄產(chǎn)物作為PCR模板 (50μl反應體系)。
