Q：提取過(guò)程中 RNA 降解

A：

? 材料中的 RNA 發(fā)生降解：盡量選擇新鮮的材料，材料采集后應迅速用液氮處理。材料

保存在液氮中或 -70℃條件下，材料均不宜長(cháng)期保存，且避免反復凍融。幼嫩新鮮的材料 RNA 含量高且完整，衰老或病害等受損的材料中 RNA 降解比較嚴重。

? 操作環(huán)境的 RNase 污染：RNA 提取盡量選擇潔凈的環(huán)境，由于自然條件下空氣中含有較多的 RNase，建議對提取環(huán)境進(jìn)行 RNase 的清除處理。

? 提取用具帶來(lái)的 RNase污染：提取用所有的玻璃器皿可通過(guò)高溫滅活 (160℃烘烤 4-5 小時(shí))去除 RNase。RNA 材料所接觸的所有塑料制品 (如槍頭、電泳槽、移液器等)都需要通過(guò) DEPC 或 NaOH 處理嚴格去除 RNase 后才可使用。

? 操作中帶入的 RNase 污染：人的皮膚、汗液和呼出的氣體中含有大量的 RNase。操作人

員可通過(guò)經(jīng)常更換一次性手套，佩戴口罩等措施減少此類(lèi)污染。

Q：RNA 提取量低

A：

? 材料 RNA 含量較低：對于 RNA 含量較低的纖維組織 (肌肉組織或纖維素較高的植

物組織) 可適當提高起始材料的用量。

? 材料中蛋白和脂肪含量較高：蛋白和脂肪含量較高的材料可用氯仿對上清再次抽提。

? RNA 沉淀條件不合適：使用異丙醇沉淀 RNA 時(shí)，加入的異丙醇與提取液的比例為嚴

格的 1:1，否則會(huì )明顯影響 RNA 沉淀的效率和 RNA 的純度。特殊材料 (如含有多糖、多酚等) 可通過(guò)添加適量的檸檬酸鈉來(lái)改善沉淀效果。

Q：RNA 中有基因組 DNA 污染

A：

? 材料中核酸含量高：脾臟、胸腺等組織中的核酸含量較高，可進(jìn)行多次酚 / 氯仿抽

提以去除多余的 DNA。也可以在提取后加入 DNase I 處理，降解 DNA。

? 材料過(guò)量：增加試劑用量。

? RNA 沉淀條件不合適：使用異丙醇沉淀 RNA 時(shí)，加入的異丙醇與提取液的比例偏高，

溶液的 pH 值偏小，都容易使 DNA 形成沉淀。

Q：提取后的 RNA 樣品降解

A：

? RNA 樣品反復凍融：反復凍融會(huì )使 RNA 片段斷裂，影響 RNA 的完整性。

? RNA 樣品保存條件不合適：根據保存時(shí)間和材料的不同，RNA 應保存在不同的溶液中。

如從胰臟、肝臟等 RNase 含量較高的材料中提取的樣品需要儲存在甲醛或甲酰胺中以保存高質(zhì)量的 RNA，而在脾臟中提取的 RNA 可在水中長(cháng)期穩定保存。