Q：蛋白不表達或表達量很低？

A：

1、選擇正確的表達載體與表達菌株

? T7啟動(dòng)子的載體(如pET系列載體)應選用BL21(DE3)，BL21(DE3) pLysS，Transetta(DE3) 等菌株。非T7啟動(dòng)子的表達載體 (如Tac啟動(dòng)子的pGEX、pMAL系列表達載體) 應選用BL21表達菌株。

? 對細胞有毒性的蛋白，建議選用背景表達低、嚴謹調控誘導的菌株，如BL21(DE3) pLysS菌株。

? 對于帶有稀有密碼子的蛋白或來(lái)源于真核基因的蛋白，建議選用Transetta(DE3) 等菌株。

2、嘗試不同的表達載體與菌株

   不同的蛋白，對不同載體與菌株的偏好不同，如果某一蛋白無(wú)法通過(guò)優(yōu)化誘導表達條件得到明顯改善，可以更換其它菌株或表達載體。

3、表達條件的優(yōu)化

? 選擇不同的培養基。對于某些蛋白，在培養基中加入適量的葡萄糖(0.1%-0.5%)，可以明顯提高表達量。

? 較高的溫度、較高的誘導物濃度、較長(cháng)的表達時(shí)間，一般可以加快表達的速度，促進(jìn)目的蛋白的積累，從而提高表達量。但可能會(huì )降低可溶蛋白的表達量，形成包涵體。

? 細胞的生長(cháng)狀態(tài)對蛋白表達有很大的影響，可以通過(guò)測量菌液的OD600值監測生長(cháng)狀態(tài)。對于大部分蛋白，應在菌株的對數生長(cháng)期(OD600=0.5) 進(jìn)行誘導。

Q：目的蛋白不可溶，形成包涵體？

A：

首先確認目的蛋白是否有表達。

? 裂解菌體并離心后，通過(guò)對全菌、上清、沉淀的檢測，確認目的蛋白是否表達，是否形成了包涵體。

? 包涵體的形成與蛋白自身結構、表達系統、誘導表達條件等因素有著(zhù)密切關(guān)系。在無(wú)法改變蛋白自身結構的情況下，可以嘗試不同的表達載體與菌株，增強其溶解能力，優(yōu)化出適合特定蛋白的表達系統。

? 目前認為包涵體的形成是由于蛋白在細胞內積累速度過(guò)快，沒(méi)有正確折疊而聚集沉淀?？梢酝ㄟ^(guò)優(yōu)化誘導表達條件，如降低誘導溫度、降低誘導物濃度、縮短表達時(shí)間、降低誘導時(shí)菌液的OD值等，以減緩蛋白的積累。

Q：目的蛋白大小不正確？

A：

? 蛋白的結構對判斷分子量大小有一定影響?？梢酝ㄟ^(guò)加熱變性蛋白，從而準確判斷蛋白分子量大小。

? 確認蛋白表達是否完整，蛋白是否提前終止表達。

? 若形成二聚體甚至多聚體，可以通過(guò)加熱變性蛋白、打開(kāi)二硫鍵 (加入DTT、β-ME等還原劑) 等手段，破壞次級結構，準確判斷分子量大小。

RNA純化常見(jiàn)問(wèn)題解答

Q：提取過(guò)程中 RNA 降解

A：

? 材料中的 RNA 發(fā)生降解：盡量選擇新鮮的材料，材料采集后應迅速用液氮處理。材料

保存在液氮中或 -70℃條件下，材料均不宜長(cháng)期保存，且避免反復凍融。幼嫩新鮮的材料 RNA 含量高且完整，衰老或病害等受損的材料中 RNA 降解比較嚴重。

? 操作環(huán)境的 RNase 污染：RNA 提取盡量選擇潔凈的環(huán)境，由于自然條件下空氣中含有較多的 RNase，建議對提取環(huán)境進(jìn)行 RNase 的清除處理。

? 提取用具帶來(lái)的 RNase污染：提取用所有的玻璃器皿可通過(guò)高溫滅活 (160℃烘烤 4-5 小時(shí))去除 RNase。RNA 材料所接觸的所有塑料制品 (如槍頭、電泳槽、移液器等)都需要通過(guò) DEPC 或 NaOH 處理嚴格去除 RNase 后才可使用。

? 操作中帶入的 RNase 污染：人的皮膚、汗液和呼出的氣體中含有大量的 RNase。操作人

員可通過(guò)經(jīng)常更換一次性手套，佩戴口罩等措施減少此類(lèi)污染。

Q：RNA 提取量低

A：

? 材料 RNA 含量較低：對于 RNA 含量較低的纖維組織 (肌肉組織或纖維素較高的植

物組織) 可適當提高起始材料的用量。

? 材料中蛋白和脂肪含量較高：蛋白和脂肪含量較高的材料可用氯仿對上清再次抽提。

? RNA 沉淀條件不合適：使用異丙醇沉淀 RNA 時(shí)，加入的異丙醇與提取液的比例為嚴

格的 1:1，否則會(huì )明顯影響 RNA 沉淀的效率和 RNA 的純度。特殊材料 (如含有多糖、多酚等) 可通過(guò)添加適量的檸檬酸鈉來(lái)改善沉淀效果。

Q：RNA 中有基因組 DNA 污染

A：

? 材料中核酸含量高：脾臟、胸腺等組織中的核酸含量較高，可進(jìn)行多次酚 / 氯仿抽

提以去除多余的 DNA。也可以在提取后加入 DNase I 處理，降解 DNA。

? 材料過(guò)量：增加試劑用量。

? RNA 沉淀條件不合適：使用異丙醇沉淀 RNA 時(shí)，加入的異丙醇與提取液的比例偏高，

溶液的 pH 值偏小，都容易使 DNA 形成沉淀。

Q：提取后的 RNA 樣品降解

A：

? RNA 樣品反復凍融：反復凍融會(huì )使 RNA 片段斷裂，影響 RNA 的完整性。

? RNA 樣品保存條件不合適：根據保存時(shí)間和材料的不同，RNA 應保存在不同的溶液中。

如從胰臟、肝臟等 RNase 含量較高的材料中提取的樣品需要儲存在甲醛或甲酰胺中以保存高質(zhì)量的 RNA，而在脾臟中提取的 RNA 可在水中長(cháng)期穩定保存。