（一）“一種利用qPCR精確定量不同GC含量的二代測序文庫的方法及試劑盒”
2019年08月13日，全式金獲此項專(zhuān)利授權，專(zhuān)利號:ZL201610864592.0。
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用qPCR精確定量不同GC含量的二代測序文庫的方法及試劑盒。首先提供了利用qPCR精確定量不同GC含量的二代測序文庫的試劑盒，包含：多個(gè)不同GC含量的標準品，文庫稀釋液，qPCR預混液，引物，ddH2O。還提供了利用上述試劑盒進(jìn)行qPCR精確定量不同GC含量的二代測序文庫的方法。本發(fā)明試劑盒和方法定量精確、使用方便、適用范圍廣、選擇性強、靈敏度高、特異性好、穩定性好，為高質(zhì)量高效率的測序提供了保證。
我公司應用此專(zhuān)利技術(shù)自主研發(fā)的定量試劑盒“TransNGS? Library Quantification Kit for Illumina （KQ101）” 特點(diǎn)：
· 線(xiàn)性標準品，定量更精確。
· 選擇性強、定量更精確，精心設計多種不同GC 含量的標準品。
· 特異性強，只擴增雙端接頭完整的文庫分子。
· 操作簡(jiǎn)便，直接使用預先稀釋好的標準品，包含絕對定量所有必需組分。
· 擴增效率與靈敏度高，特別優(yōu)化的qPCR 體系與程序。
· 適用范圍廣，可擴增AT/GC 含量高的模板。
· 兼容性好，兼容所有主流qPCR 儀器。
· 穩定性好，重復性好。
（1）產(chǎn)品穩定性
分別使用不同批次產(chǎn)品進(jìn)行qPCR 檢測，結果顯示，4 個(gè)批次的標準品(S6-S1) 的Ct 值均無(wú)明顯差異，繪制的標準曲線(xiàn)方程非常穩定，標準品批次間穩定性非常好。
（2）與主流產(chǎn)品的對比
分別使用TransGen、K 公司、N 公司及V 公司產(chǎn)品對6 個(gè)不同物種的文庫進(jìn)行定量，結果顯示，TransGen 與K 公司對6 個(gè)文庫定量結果無(wú)明顯差異，而其它兩種產(chǎn)品結果明顯偏高或偏低，TransGen 產(chǎn)品定量結果與金標準K 公司產(chǎn)品定量結果一致。
（3）產(chǎn)品極限數據
分別使用TransGen 及K 公司產(chǎn)品對6 個(gè)差異明顯的文庫進(jìn)行定量，結果顯示，TransGen 對不同種屬文庫、不同GC含量、不同長(cháng)度、不同濃度的文庫都可以精確檢測，與金標準K 公司一致，這說(shuō)明產(chǎn)品適用范圍廣。文庫檢測合格后，按照文庫定量結果將相同量的不同文庫Pooling 至同一條Lane 后進(jìn)行Illumina HiSeq 測序，數據分析顯示，NGS 能獲得預期量的clean reads, 并且根據TransGen 與K 公司定量結果所獲得的數據量無(wú)明顯差異。
分別使用TransGen 與K 公司文庫定量產(chǎn)品對5 種同一濃度的不同GC 含量（25%、37.5%、50%、62.5%、75%）的標準品進(jìn)行qPCR 檢測，結果顯示，不同GC 含量的標準品的Ct 值差異小，都可很好地擴增。表明TransGen 產(chǎn)品適用范圍廣，與金標準K 公司產(chǎn)品相當。
（4）產(chǎn)品特色與優(yōu)勢
· 精心設計5 種不同GC 含量的線(xiàn)性標準品，選擇性更強，定量更精確。
分別使用5 種不同GC 含量（25%、37.5%、50%、62.5%、75%）的標準品繪制標準曲線(xiàn)，定量天藍色鏈霉菌（左，72%GC）與擬南芥（右，36% GC）這兩個(gè)DNA 文庫的濃度，結果顯示，不同GC 含量標準品定量結果差異明顯。如果以50% GC Standards 作為標準品，其定量結果明顯會(huì )相對偏小(p 值都小于0.001，n=4)。因此，天藍色鏈霉菌的DNA文庫應該選擇75% GC Standards 而擬南芥則選擇37.5% GC Standards 分別作為其最佳標準品，文庫定量結果會(huì )更加精確，確保獲取更高質(zhì)量的測序結果。
（二）“一種適用于高效反轉錄反應的反轉錄引物組合”
2019年08月13日，全式金獲此項專(zhuān)利授權，專(zhuān)利號：ZL201710031139.6。
本發(fā)明公開(kāi)了一種適用于高效反轉錄反應的反轉錄引物組合，所述反轉錄引物組合由帶有oligo(dT)結構的引物和半隨機引物組成，還公開(kāi)了所述反轉錄引物在反轉錄反應中的應用。本發(fā)明反轉錄引物組合在保留了錨定引物優(yōu)勢的同時(shí)，避免了普通隨機引物所引起的堿基錯配和非隨機配對，消除傳統反轉錄引物對于mRNA模板5’端、3’端的合成效率偏好性，使mRNA模板各位點(diǎn)能夠均勻、無(wú)差錯地合成到相對應的cDNA中，從而顯著(zhù)提升反轉錄效率與數據均一性、穩定性。
除一步法外，Trans RT系列產(chǎn)品均配有Anchored Oligo（dT），結合位點(diǎn)鉚釘，特異性高，跨越Poly（A）+結構，保證cDNA合成效率和成功率。
在此我們要重點(diǎn)介紹一下我司的反轉錄All-in-One系列產(chǎn)品:
1)TransScript? All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for PCR（AT321）；
2)TransScript? II All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for PCR（AH321）；
這兩款產(chǎn)品含有反轉錄反應所需的全部試劑，只需加入模板RNA和RNase-free water即可反應。最大程度地簡(jiǎn)化了操作步驟, 降低了污染幾率；反轉錄反應僅需30min；最佳Anchored Oligo(dT) Primer和Random Primer(N9)配比，長(cháng)鏈cDNA合成效率高；兩款產(chǎn)品反轉錄產(chǎn)物適用于PCR（也可用于qPCR）。
·TransScript? All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for PCR合成長(cháng)度，TransScript≤12kb；
·TransScript? II All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for PCR合成長(cháng)度， TransScriptⅡ≤15kb；高熱穩定性：反應溫度42℃-55℃，最佳反應溫度為50℃；適用于高拷貝、低拷貝基因檢測；突出高GC含量或具有復雜二級結構的RNA模板。
3)TransScript? All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removal）（AT341）；
4)TransScript? II All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removal）（AH341）。
這兩款產(chǎn)品含有反轉錄反應所需的全部試劑，只需加入gDNA Remover，模板RNA和RNase free water即可反應。最大程度地簡(jiǎn)化了操作步驟, 降低了污染幾率；整個(gè)反轉錄反應僅需15 min；由最佳的Anchored Oligo(dT) Primer和Random Primer(N9)配比，及優(yōu)化的SuperMix組成，確保對不同濃度的RNA有相同的反轉錄效率，短鏈cDNA合成效率高；該Mix中含有gDNA Remover組分，在同一反應管中，同時(shí)完成反轉錄與基因組DNA的去除，降低污染幾率，保證后續qPCR實(shí)驗結果更加理想。
兩項發(fā)明專(zhuān)利的同時(shí)授權既是我公司的榮譽(yù)，也是對我公司技術(shù)水平的肯定，全式金將繼續堅持自主研發(fā)、創(chuàng )新的發(fā)展模式，為廣大客戶(hù)朋友們提供高性?xún)r(jià)比的產(chǎn)品，助力生命科學(xué)的研究和發(fā)展。
